殼聚糖酶的分離純化及性質(zhì)研究

摘要：利用芽孢桿菌（Bacillus sp.）Yg菌株發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶，采用分段醇析法分離純化發(fā)酵產(chǎn)物，通過不連續(xù)SDS-PAGE法測定殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物先用體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇初步醇析，離心去除沉淀，而后加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為60%再次醇析，所得沉淀冷凍干燥即為殼聚糖酶，所得酶的回收率和純度均較高。所得殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為41.7 ku，最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最佳反應(yīng)pH為5.5。該酶在4 ℃條件下保存穩(wěn)定性較好，在65 ℃及以上溫度下短時(shí)間內(nèi)即全部失活。

關(guān)鍵詞：殼聚糖酶；發(fā)酵；純化；酶活力；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：TQ925+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）15-3647-03

殼寡糖為殼聚糖降解產(chǎn)物，具有水溶性好、易吸收、無毒、無變異性的特性，具有很高的生物活性，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[1，2]。殼聚糖酶是專一性水解殼聚糖生成殼寡糖的酶，殼聚糖酶水解法是目前制備殼寡糖的最佳方法[3]。我國目前還沒有自主研發(fā)的殼聚糖酶制品，殼聚糖酶的研究與開發(fā)利用已成為我國殼寡糖生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵與瓶頸。本研究利用前期自行分離獲得的產(chǎn)殼聚糖酶芽孢桿菌（Bacillus sp.）Yg菌株發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，并對(duì)殼聚糖酶的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌Yg菌株由廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院提供。殼聚糖（脫乙酰度>80%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。Marker：MBP-[3-galactosidase（175 ku）、MBP-CBD（62 ku）、Triosephosphate isomerase（32.5 ku）、β-Lactoglobulin A（25 ku）。丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、過硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250、無水乙醇、冰醋酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備及活力測定 Yg菌株接種PDA液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h制備種子液，按5%的接種量接于產(chǎn)酶培養(yǎng)基（NaCl 5 g/L、KCl 5 g/L、MgSO4·7H2O 5 g/L、K2HPO4 0.75 g/L、FeSO4 0.01 g/L、蛋白胨 8.5 g/L、牛肉膏 0.25 g/L、殼聚糖 10 g/L，pH 7.5～8.0）中，30 ℃、180 r/min發(fā)酵培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液5 000 r/min、4 ℃離心20 min得粗酶液。45 ℃預(yù)熱后將粗酶液按10%的體積分?jǐn)?shù)加入30 g/L的殼聚糖膠體溶液中，45 ℃、180 r/min條件下反應(yīng)，定時(shí)取樣，1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 8.0，沸水浴20 min終止反應(yīng)，離心取沉淀，烘干稱重，計(jì)算酶活力。以每分鐘催化1 μg不溶性殼聚糖轉(zhuǎn)化為水溶性低聚糖所需要的酶量作為一個(gè)酶活力單位（U）[4]。

1.2.2 殼聚糖酶的分離及活力測定 發(fā)酵液中加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min、4 ℃離心10 min[5]，分別測定上清液與沉淀中的殼聚糖酶活力，確定分離殼聚糖酶的乙醇濃度。在最適條件下對(duì)殼聚糖酶進(jìn)行醇析分離，真空冷凍干燥制得殼聚糖酶粉。殼聚糖酶粉加蒸餾水溶解，按“1.2.1”方法測定其活力。

1.2.3 殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量的測定 采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳[6]測定殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量。制膠、上樣后10 mA電泳分離，指示劑到達(dá)濃縮膠與分離膠分界線時(shí)調(diào)電流為20 mA，電泳后去除濃縮膠、染色、脫色。依據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品的相對(duì)遷移距離計(jì)算殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.4 殼聚糖酶反應(yīng)條件研究[7] 分別于25、35、45、 55、65 ℃條件下測定殼聚糖酶活力，確定該酶的最適反應(yīng)溫度；分別于pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0條件下測定殼聚糖酶活力，確定該酶的最適反應(yīng)pH。

1.2.5 殼聚糖酶熱穩(wěn)定性研究[8] 將殼聚糖酶分別置于4 ℃、25 ℃（室溫）、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下保存一定時(shí)間后測定酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖酶醇析條件的選擇

經(jīng)測定，原酶液中殼聚糖酶活力為1 895 U/mL。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇醇析后，分別測定上清液與沉淀中殼聚糖酶的酶活力，并換算為原酶液每毫升所得上清液及沉淀的酶活力，測定結(jié)果見表1。從表1可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，上清液中酶活力逐漸降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于50%時(shí)，上清液中殘余酶活為0；而沉淀中酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先呈升高趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，沉淀中酶活力隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高有所降低。綜合判斷，殼聚糖酶最佳醇析條件確定為先用體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇初步醇析后離心去除沉淀，而后加乙醇至體積分?jǐn)?shù)為60%再次醇析，取沉淀冷凍干燥后即得殼聚糖酶粉。經(jīng)測定此種分離方法所得殼聚糖酶酶活力的回收率達(dá)81.9%。

2.2 殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量測定結(jié)果

經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE法測定殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，純化后的殼聚糖酶樣品經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離得到一個(gè)條帶，說明Yg菌株所產(chǎn)殼聚糖酶為單一酶組分，且通過醇析法可分離純化殼聚糖酶達(dá)到電泳純。通過測量相對(duì)遷移距離，計(jì)算得出殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為41.7 ku。

2.3 殼聚糖酶的最適反應(yīng)條件

對(duì)純化后殼聚糖酶粉在不同反應(yīng)溫度及pH下的酶活力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2和圖3。由圖2和圖3可知，隨著反應(yīng)溫度和pH的升高，殼聚糖酶的活力均呈先升高后降低的變化趨勢，在溫度45 ℃、pH 5.5時(shí)酶活力最高。

2.4 殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性

所得殼聚糖酶初始酶活力測定為4 596 U/mg，在不同保存條件下殼聚糖酶活力的測定結(jié)果見表2。從表2可以看出，殼聚糖酶活力隨保存時(shí)間的延長而降低，保存溫度越高酶活力下降速度越快。其中在4 ℃下保存90 d時(shí)酶活力仍高達(dá)3 984 U/mg，為保存初期的84.7%；而在25 ℃（室溫）下保存7 d后酶活力約為初始保存時(shí)的81.6%，30 d時(shí)酶活力僅為117 U/mg，90 d時(shí)酶活力已完全喪失；在較高溫度（65、75 ℃）下保存，酶在短時(shí)間內(nèi)即完全失活。可見試驗(yàn)分離得到的殼聚糖酶適合在低溫條件下保存。

3 小結(jié)與討論

利用Yg菌株發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶，采用分段醇析法分離純化發(fā)酵產(chǎn)物，通過不連續(xù)SDS-PAGE法測得殼聚糖酶相對(duì)分子質(zhì)量約為41.7 ku，所得殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃，最佳反應(yīng)pH為5.5。該酶在4 ℃條件下保存穩(wěn)定性較好，在65 ℃及以上溫度下短時(shí)間內(nèi)即全部失活。

由醇析過程中酶活力的變化情況可以看出，醇析可造成殼聚糖酶活力的少量損失。殼聚糖酶粉的最適反應(yīng)溫度和pH與原酶液相同，說明醇析和冷凍干燥對(duì)殼聚糖酶性質(zhì)的影響不大。

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