羔羊卵母細胞體外胚胎生產影響因素分析

摘要：利用幼畜胚胎體外生產與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術能夠獲得大量卵母細胞，縮短世代間隔，加快育種進程。但幼畜卵母細胞形態及代謝與成年動物存在差異，這導致幼畜胚胎發育能力低。目前，對JIVET技術的研究主要是通過改進激素處理方案及體外培養條件來增加卵母細胞數量并增強卵母細胞發育能力。從供體羔羊的選擇、激素處理和卵母細胞的發育等方面對該技術進行了分析。

關鍵詞：幼畜胚胎體外生產與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術；羔羊；卵母細胞

中圖分類號：S826；S814.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4726-04

幼畜胚胎體外生產與胚胎移植（Juvenile in vitro embryo transfer，JIVET）技術是集幼畜超數排卵、卵母細胞的體外成熟和體外受精、胚胎體外培養和胚胎移植為一體的高新技術體系。利用JIVET技術能夠獲得大量卵母細胞，縮短優良母畜繁殖的世代間隔，加快品種培育的進程[1]。與傳統的綿羊超數排卵和胚胎移植（MOET）方案相比，由于生產體外胚胎的卵母細胞供體母畜的年齡提前到8～12周齡，故生產后代羔羊的世代間隔縮短為6個月，同時還大大增加了后代數量，繁殖效率成倍提高。此外，JIVET技術結合性控精液進行后代生產，也能提高基因遺傳率約5%，這為該技術的商業化應用提供了非常廣闊的應用前景。

JIVET技術應用的原理在于羔羊出生后的前2個月卵巢生長較快，卵巢的質量在4周齡和8周齡時分別增加了6.8倍和10.8倍，生長卵泡數量在4周齡時顯著增加[2]。生長卵泡數量和卵巢的質量在8～12周齡時下降，一直持續到33周齡[2]。卵泡在4周齡時出現閉鎖信號，在8～10周齡時達到最大值[3]。這些結果顯示3～8周齡時卵泡生長旺盛，能搜集到大量的未閉鎖卵母細胞。研究表明，羔羊對外源促性腺激素起反應，但部分羔羊對激素不敏感[3]。與成年羊相比，羔羊胚胎體外培養時以及移植到受體后的發育能力都很低[4]，這導致胚胎移植后胎兒流產和畸形率高[5]，極大地制約了JIVET技術的商業化應用。而通過選擇適當的激素處理方案和體外胚胎生產體系能顯著提高3～4周齡羔羊生產后代的能力[6，7]。目前研究表明，影響JIVET效率的因素主要包括供體的選擇、超排方案和卵母細胞的發育能力等[8，9]。本文就羔羊JIVET技術的影響因素進行系統分析。

1 供體羔羊的選擇

理想的供體羔羊在激素處理后將產生大量的卵泡和高發育能力的卵母細胞。影響供體羔羊選擇的因素包括遺傳背景、年齡等。

1.1 遺傳背景

羔羊遺傳背景主要包括品種、基因型和個體差異等。國內外研究結果表明，成年后排卵數高的綿羊品種性成熟前卵巢和卵泡發育滯后于成年后排卵數低的品種，且前者對激素的敏感性低于后者[10，11]。Sonjaya等[12]對剛出生的羔羊卵巢進行組織切片觀察，發現法蘭西（成年后排卵數低）各級卵泡數比羅姆尼（成年后排卵數高）多，且前者各級卵泡直徑大于后者。4周齡時，法蘭西3級卵泡數量多于羅姆尼，且前者直徑大于后者。外源激素分別處理4周齡羔羊，能夠誘導法蘭西羔羊排卵，而羅姆尼不反應。白佳樺[10]用相同激素處理方法處理幾個品種的羔羊，平均每只羔羊采集到的卵母細胞數排卵數高的品種顯著低于排卵數低的品種。多胎基因FecB能夠影響羔羊卵泡發育，3月齡不攜帶FecB基因的布魯拉羊（Booroola）比攜帶FecB基因的布魯拉羊擁有更多的大卵泡[11]。Ptak等[13]發現一只羔羊卵母細胞具有很高的發育能力，其生產的5只同胞羔羊的卵母細胞同樣具有很高的發育能力，這說明基因型一致的羔羊卵母細胞發育能力也趨于一致。

1.2 供體年齡

不同年齡段羔羊激素處理后卵巢反應不同。Armstrong[14]認為激素處理羔羊的最佳年齡為4～6周齡，因為此時大部分卵泡處于應答狀態。O’Brien等[15]指出，3～6周齡羔羊卵母細胞超排效果好于16～24周齡羔羊。Morton等[6]用激素處理不同年齡（3～4周齡和6～7周齡）羔羊，發現羔羊年齡影響到子宮質量，但對卵巢質量、卵泡數量和獲得的卵母細胞數量沒有影響。然而，6～7周齡羔羊卵母細胞囊胚率（27.9%）高于3～4周齡羔羊（20.4%），證明羔羊隨著年齡的增長其卵母細胞發育能力增強。盡管如此，年輕的羔羊（4～6周齡）激素處理效果和最終獲得的后代數顯著高于年長的羔羊。

2 激素誘導應答

幼畜對激素的應答個體差異很大[5，13]。Ptak等[13]發現50%～72%的2～7月齡羔羊對激素反應（卵泡數量和大小）不明顯。相反，Morton等[6]發現所有3～4周齡羔羊卵巢對激素應答，其中24%應答弱，44%應答中等，32%應答強；對6～7周齡羔羊的試驗結果也相差不大。Ptak等[5，13]發現對激素應答弱的羔羊卵母細胞體外培養后不能發育至囊胚。相反，Morton等[6]發現3～4周齡和6～7周齡羔羊卵巢激素應答弱的卵母細胞具有發育到囊胚的能力。然而，激素應答弱和應答中等的羔羊卵巢其可用卵母細胞百分比無顯著差異，但高于激素應答強的羔羊。3～4周齡羔羊不同激素應答強度的卵母細胞卵裂率和囊胚率無顯著差異；但6～7周齡羔羊激素應答強的卵母細胞卵裂率低[6]。激素處理方案的改變使更多的羔羊對激素應答，提高了JIVET效率。選擇適當的激素處理方法能使大部分羔羊應答明顯。

3 激素處理方法

激素處理羔羊能增加卵巢中可用卵泡數量，并獲得大量卵母細胞[6，15]。激素處理后羔羊卵母細胞發育速度加快[6，15]。幼畜卵巢對激素應答及卵母細胞發育能力增強的確切機制還不清楚。激素應答過程伴隨著卵泡變大及卵母細胞生物合成反應的進行[14]，為卵母細胞受精后的發育做準備。激素處理后，羔羊卵泡細胞內化學物質和卵泡內環境發生改變[15]。例如，誘導顆粒細胞內促性腺激素受體的形成，促使卵泡對促性腺激素反應能力增強，從而提高卵母細胞質量和功能。羔羊超數排卵的激素用法一般參照成年羊超排方案，即促性腺激素法或孕酮結合促性腺激素法。

3.1 促性腺激素法

單次或多次注射促卵泡成熟激素（FSH）不能影響每只羔羊采集的卵母細胞數量[5，16]。然而，多次FSH處理能提高卵母細胞發育到囊胚的能力[5，17]。羔羊超數排卵的激素用量低于成年綿羊，因為羔羊體重低于成年羊且羔羊卵泡對激素非常敏感[2]。但相比成年動物，低劑量促性腺激素造成激素與卵母細胞結合的量減少，這就造成卵母細胞體外成熟時發育能力減弱。研究表明大劑量促性腺激素能提高幼畜卵母細胞細胞質成熟能力。目前，羔羊JIVET的最佳FSH劑量為130～160 mg[6，17，18]。馬絨毛膜促性腺激素（eCG）不能增加羔羊超數排卵后采集的卵母細胞數量，但能提高其囊胚率[17，18]。目前報道的能顯著提高卵母細胞囊胚率的超排方法是每隔12 h注射1次FSH（40 mg/次），連續注射4次，最后1次注射FSH時同時注射500 IU eCG，在第一次注射FSH后48 h采集卵母細胞[17]。

3.2 孕酮+促性腺激素法

促性腺激素和孕酮一起使用能增加幼畜超排的卵母細胞數量和體外發育能力[6，15]。孕酮處理7 d后停藥，卵巢上可見卵泡比未用藥前多了2倍[16]。然而，停藥后卵母細胞處于不同的成熟期，說明孕激素處理雖然增加了卵泡的數量，但降低了卵母細胞質量。且孕激素處理后再注射FSH與僅注射FSH相比沒有影響采集到卵母細胞數量。

4 幼畜卵母細胞形態和代謝特點

研究表明，幼年動物和成年動物卵母細胞的細胞器在形態上存在明顯不同。比如，同期幼年動物卵母細胞比成年動物卵母細胞的直徑小，但GV期時其胞質細胞器（如線粒體、高爾基體、內質網和脂滴）形態和成年動物相似[19]。而幼年動物放射冠細胞觸角比成年動物少，體外成熟時皮質顆粒遷移延遲[16]。

卵母細胞成熟時蛋白質的合成依靠卵母細胞和卵丘細胞相互作用，這是卵母細胞減數分裂及胚胎正常發育的前提[20]。體外成熟過程中卵母細胞攝入的氨基酸[21-23]及合成的蛋白質[23]很少，幼年動物卵母細胞蛋白質合成峰值出現的時間與成年動物不同[23]，這是因為卵丘-卵母細胞間相互作用存在缺陷[21，22]。此外，幼年動物卵母細胞內成熟促進因子（MPF）合成水平和構象與成年動物相似，但成熟后幼年動物卵母細胞MPF活性低于成年動物[22]。

幼年動物卵母細胞代謝也不同于成年動物。體外成熟過程中幼年動物卵母細胞谷氨酰胺代謝水平低于成年動物，葡萄糖和丙酮酸代謝水平和成年動物相似。以上結果表明幼年動物卵母細胞形態、代謝和超微結構與成年動物有所不同，但這些研究所用的羔羊年齡范圍大（40 d至6個月），且所用的激素處理方案不同，這些可能影響到試驗結果。

5 幼年動物卵母細胞的體外發育潛力

與成年動物卵母細胞相比，幼年動物卵母細胞成熟時減數分裂速率相差不大[22]， 且幼年動物卵母細胞體外生產的囊胚在形態上無差別，其總細胞數[23，24]及內細胞團細胞數與總細胞數比率[23，24]差異不顯著，但其異常受精率高[22，23]且囊胚率低[13，17]。目前一般將這種情況歸結于細胞質成熟的紊亂。細胞質成熟紊亂會造成受精異常，不能形成正常的雄原核，不能阻止多精入卵，阻止受精卵繼續發育。最終造成胚胎基因組表達異常，預附植時胚胎丟失，附植后胚胎發育失敗[14]。不僅胚胎成活率低，胎兒丟失率[5，13，15]和木乃伊化比率[5]也高。Ptak等[25]報道稱妊娠中斷發生在妊娠第40～60天，胎兒丟失發生在妊娠第80～100天，僅僅6%胚胎能發育并完成整個妊娠期。

6 小結與展望

限制JIVET技術商業化的因素包括幼畜對激素的反應不穩定、卵母細胞發育能力低等。但通過使用高劑量FSH能誘導所有羔羊卵巢發育[6]。品種和基因型也會影響幼畜超數排卵效果[17，18]。目前，有學者研究的羔羊卵母細胞發育能力和成年羊沒有區別，且移植后妊娠率高[17，18，26]。所以通過選育特定基因型通過JIVET技術育種或許是一個不錯的選擇。

基因組學能讓我們更深入地研究成年動物和幼年動物的區別。目前已發現幼畜胚胎內幾種重要的發育相關基因的表達與成年動物不同[27，28]。Ptak等[25]發現羔羊胚胎移植后胎兒發育停滯是由于全基因組甲基化水平低造成的。這些基因表達水平上的研究將使我們更深入地了解幼年動物和成年動物卵母細胞和胚胎的差異，為進一步改進幼畜胚胎體外生產技術提供理論支持。

目前，幼畜胚胎體外生產技術已經取得了很大的進步，Kelly等[18]進行羔羊胚胎體外生產并移植，平均每只供體羔羊能生產16只羔羊后代。而隨著幼畜胚胎體外生產效率的不斷提高，該技術也將為優良家畜繁育及新品種培育等領域提供更加廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] GRAZYNA P， MARIAN T， NICOLA B， et al. Donor-dependent developmental competence of oocytes from lambs subjected to repeated hormonal stimulation[J]. Biol Reprod，2003，69（1）：278-285.

[2] KENNEDY J P， WORTHINGTON C A， COLE E R. The post-natal development of the ovary and uterus in the Merino lamb[J]. J Reprod Fertil，1974，36（2）：275-282.

[3] TASSELL R，CHAMLEY W A， KENNEDY J P. Gonadotrophin levels and ovarian development in the neonatal ewe lamb[J]. Aust J Biol Sci， 1978，31（3）：267-273.

[4] MCMILLAN W H，MCDONALD M F. Survival of fertilized ova from ewe lambs and adult ewes in the uteri of ewe lambs[J]. Anim Reprod Sci，1985，8（3）：235-240.

[5] PTAK G， LOI P， DATTENA M， et al. Offspring from one-month-old lambs： Studies on the developmental capability of prepubertal oocytes[J]. Biol Reprod，1999，61（6）：1568-1574.

[6] MORTON K M， CATT S L， MAXWELL W M C， et al. Effects of lamb age， hormone stimulation and response to hormone stimulation on the yield and in vitro developmental competence of prepubertal lamb oocytes[J]. Reprod Fertil Dev， 2005，17（6）：593-601.

[7] 郭 洪，萬鵬程，石文艷，等. EGF和β-巰基乙醇對羔羊卵母細胞體外受精和體外發育的影響[J]. 安徽農業科學，2012，40（11）：6537-6540.

[8] MENCHACA A， VILARINO M， CRISPO M， et al. New approaches to superovulation and embryo transfer in small ruminants[J]. Reprod Fertil Develop，2010，22（1）：113-118.

[9] 陳曉勇，田樹軍，桑潤滋，等. 誘導幼羔卵泡發育及體外胚胎生產[J]. 農業生物技術學報，2008，16（3）：456-460.

[10] 白佳樺. 性成熟前綿羊、牛 JIVET技術的研究[D]. 北京：中國農業大學，2008.

[11] MCNATTY K P， LUN S， HEATH D A， et al. Ovarian follicular activity in Booroola lambs with and without a fecundity gene[J]. J Reprod Fert，1987，79（1）：57-66.

[12] SONJAYA H，DRIANCOURT M A. Ovarian follicles during infancy in Romanov and Ile-de-France ewe lambs[J]. J Reprod Fert，1987，81（1）：241-248.

[13] PTAK G， TISCHNER M， BERNABO N， et al. Donor-dependant developmental competence of oocytes from lambs subjected to repeated hormonal stimulation[J]. Biol Reprod，2003，69（1）： 278-285.

[14] ARMSTRONG D T. Effects of maternal age on oocyte developmental competence[J]. Theriogenology，2001，55（6）：1303-1322.

[15] O’BRIEN J K， BECK N F， MAXWELL W M， et al. Effect of hormone pre-treatment of prepubertal sheep on the production and developmental capacity of oocytes in vitro and in vivo[J]. Reprod Fertil Dev，1997，9（6）：625-631.

[16] PAWLAK P， CIESLAK A， WARZYCH E， et al. No single way to explain cytoplasmic maturation of oocytes from prepubertal and cyclic gilts[J]. Theriogenology，2012，78（9）：2020-2030.

[17] KELLY J M， KLEEMAN D O， WALKER S K. Enhance effciency in the production of offspring from 4-to 8-week-old lambs[J]. Theriogenology，2005，63（7）：1876-1890.

[18] KELLY J M， KLEEMAN D O， MAXWELL W M， et al. Effect of GnRH treatment on the maturation and in vitro development of oocytes collected from 4- to 6-week-old Merino lambs[J]. Reprod Fertil Dev，2007，19（8）：947-953.

[19] LEDDA S， BOGLIOLO L， LEONI G， et al. Production and lambing rate of blastocysts derived from in vitro matured oocytes after gonadotropin treatment of prepubertal ewes[J]. J Anim Sci，1999，77（8）：2234-2239.

[20] ROSE R D， GILCHRIST R B， KELLY J M， et al. Regulation of sheep oocyte maturation using cAMP modulators[J]. Theriogenology，2013， 79（1）：142-148.

[21] LEDDA S， BOGLIOLO L， LEONI G， et al. Influence of vasoactive intestinal peptide （VIP）， atrial natiuretic peptide （ANP） and insulin-like growth factors-1（IGF-1） on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes[J]. Zygote，1996，4（4）：343-348.

[22] LEDDA S， BOGLIOLO L， LEONI G， et al. Cell coupling and maturation-promoting factor activity in in vitro matured prepubertal and adult sheep oocytes[J]. Biol Reprod，2001， 65（1）：247-252.

[23] KOCHHAR H P， WU B， MORRIS L H， et al. Maturation status， protein synthesis and developmental competence of oocytes derived from lambs and ewes[J]. Reprod Domest Anim，2002， 37（1）：19-25.

[24] LEONI G G， SUCCU S， BERLINGUER F， et al. Delay on the in vitro kinetic development of prepubertal ovine embryos[J]. Anim Reprod Sci，2006，92（3-4）：373-383.

[25] PTAK G， MATSUKAWA K， PALMIERI C， et al. Developmental and functional evidence of nuclear immaturity in prepubertal oocytes[J]. Hum Reprod，2006，21（9）：2228-2237.

[26] ROMAQUERA R， MOLL X， MORATO R， et al. Prepubertal goat oocytes from large follicles result in similar blastocyst production and embryo ploidy than those from adult goats[J]. Theriogenology，2011，76（1）：1-11.

[27] DORJI， OHKUBO Y， MIYOSHI K， et al. Gene expression profile differences in embryos derived from prepubertal and adult Japanese Black cattle during in vitro development[J]. Reproduction，Fertility and Development，2012，24（2）：370-381.

[28] DORJI， OHKUBO Y， MIYOSHI K， et al. Gene expression differences in oocytes derived from adult and prepubertal Japanese Black Cattle during in vitro maturation[J]. Reproduction in Domestic Animals，2012，47（3）：392-402.