雞IL—18復合免疫增強劑對雞IFN—γ和IL—2表達的影響

摘要：為探討重組雞白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）與細胞因子誘生劑聯合使用對雞γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）和白細胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）表達的影響，應用不同濃度的雞IL-18重組菌和IL-18蛋白與2-脫氧葡萄糖（2-D-G）和植物血凝素（PHA）組成復合制劑，分別經口服、肌肉注射途徑免疫雛雞，檢測免疫后不同時間雞血清中IFN-γ和IL-2含量。結果顯示，肌肉注射含重組雞IL-18蛋白的復合制劑能夠明顯提高雞體內IFN-γ和IL-2含量，隨IL-18蛋白量的增加，IFN-γ和IL-2含量有升高趨勢，且以注射后第7～14天 IFN-γ和IL-2含量最高，分別為43 ng/L和70 ng/L，至少在第28天仍能維持較高水平；經口服途徑免疫，含雞IL-18重組菌的復合制劑也能明顯提高雞體內IFN-γ和IL-2含量，免疫后第7天，IFN-γ和IL-2含量最高，分別為50 ng/L和62 ng/L，之后稍有下降，隨IL-18重組菌量的增加，IFN-γ和IL-2表達含量變化不大。結果表明，重組雞IL-18與細胞因子誘生劑組合，經口服或注射途徑免疫，均能顯著提高雞IFN-γ和IL-2含量，為新型免疫增強劑和抗病毒制劑的研究和應用提供了參考。

關鍵詞：雞；白細胞介素-18（IL-18）；復合制劑；γ-干擾素（IFN-γ）；白細胞介素-2（IL-2）

中圖分類號：R392.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4733-04

雞白細胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）基因cDNA于2000年由Schneider等[1]首次克隆并在大腸桿菌中成功表達。中國于2003年克隆到了長約500 bp的編碼雞IL-18成熟蛋白基因[2]。2004年，河南科技大學動物疫病與公共安全實驗室從雞新城疫Ⅰ系病毒接種的雞胚脾細胞中擴增到了雞IL-18全基因[3]，并進行了真核表達和免疫增強作用的研究[4，5]。IL-18具有誘導Th1細胞和NK細胞產生γ-干擾素（IFN-γ）[6]，促進CD4+、CD8+細胞增殖，增強Th1細胞及NK細胞、CTL細胞毒活性[7]等多種生物學功能。在抗感染[8]、抗腫瘤[7]、抗寄生蟲[9]等方面都具有顯著作用，是目前研究和開發的熱點。

植物血凝集素是從菜豆屬和金雀花中提取的凝集素，能夠顯著促進脾淋巴細胞增殖[10]，促進淋巴細胞釋放諸如IFN-γ[11]和IL-2[12]等細胞因子，可作為輔助免疫增強劑使用。2-脫氧葡萄糖（2-D-G）作為葡萄糖的異構體類似物，與病毒的親和力遠遠大于葡萄糖，且病毒對兩種異構體無法識別，致使病毒無法利用其完成三羧酸循環，能量代謝受阻，病毒糖蛋白和囊膜合成受阻，無法正常生長和復制，因此，2-脫氧葡萄糖可用于禽類病毒病預防和治療的輔助性成分。

鑒于目前國內對于IL-18應用的研究主要集中在IL-18蛋白或融合蛋白對疫苗免疫增強作用，而配合其他免疫增強輔劑對雞體IFN-γ和IL-2誘導表達的研究尚不多見。本試驗參照植物血凝素（PHA）最小有效劑量[10]和生產實踐中2-脫氧葡萄糖的使用量，配合不同含量重組雞IL-18，制成復合制劑免疫雛雞，研究其對IFN-γ和IL-2誘導表達的影響，為新型具有免疫增強和抗病毒制劑的研究和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 含雞IL-18基因重組表達載體的pET28a-ChIL-18的表達菌，由河南科技大學動物疫病與公共安全實驗室構建[13]；PHA購于北京鼎國生物技術有限責任公司， 2-D-G購于上海源葉生物科技有限公司，雞IFN-γ ELISA試劑盒（ADL）、IL-2 ELISA試劑盒（ADL）均購于寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑為分析純。

1.1.2 試驗用雞 7日齡非免疫雛雞由非免疫雞胚孵化。

1.2 方法

1.2.2 試驗動物與分組 7日齡個體大小相近的非免疫雛雞330只，隨機分為口服試驗組（A）、注射試驗組（B）和對照組（C，其中C1為空白對照組，C2、C3為口服對照組，C4、C5為肌肉注射對照組），A、B每組各90只，C組150只。按表1進行免疫。

1.2.3 雞體IFN-γ和IL-2含量測定 按表1處理后第7、14、21、28天，各組隨機取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測定IFN-γ和IL-2含量。

2 結果與分析

2.1 口服試驗組IFN-γ和IL-2含量

口服試驗組分別于免疫后第7、14、21、28天，各組隨機取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測定IFN-γ和IL-2含量，結果如圖1、圖2。

由圖1可知，口服組免疫后7 d，C2、C3組與C1組IFN-γ含量有明顯差異，A1、A2、A3組與C1、C2、C3組IFN-γ含量差異明顯，增加IL-18含量對提升雞群體內IFN-γ含量無明顯效果；免疫后14 d，A1、A2、A3組與C1、C2、C3組IFN-γ含量有明顯差異并至少可延續到第28天，而A1、A2、A3組間無明顯差異；說明IL-18與輔劑配合使用有明顯效果，經口服途徑增加IL-18效果不明顯。

由圖2知，口服組免疫后7 d，A1、A2、A3與C1、C2、C3組IL-2有明顯差異，試驗A1、A2、A3組間無明顯差異，說明口服途徑提升IL-18含量對雞群體內IL-2含量無明顯影響；免疫后第14天，A1組與C1組有明顯差異，A2、A3組與C1組有明顯差異，A1、A2、A3與C2、C3組差異明顯，說明該階段雞群血清中IL-2含量仍顯著高于未免疫組，且其能較長時間維持在高水平狀態。

2.2 肌肉注射試驗組IFN-γ和IL-2含量

肌肉注射試驗組分別于免疫后第7、14、21、28天，各組隨機取7只雞，心臟采血，分離血清，試劑盒測定IFN-γ和IL-2含量，分別見圖3、圖4。

由圖3可知，肌肉注射免疫后第7天，C4、C5組與C1組有明顯差異，B1、B2、B3組與C4、C5組有明顯差異；免疫后14 d，B1、B2、B3組間無明顯差異；免疫后第21天，肌肉注射B3組與各組均有明顯差異，說明提升IL-18含量具有明顯增強雞IFN-γ誘導表達的效果。

由圖4可知，肌肉注射免疫后第7天，B1、B2、B3組與C1、C4、C5組有明顯差異，而B3組也與B1、B2組有明顯差異，說明肌肉注射途徑增加IL-18可以明顯提高雞群血清中IL-2含量；乃至處理后第28天，B3組與B1、B2組仍有明顯差異，表明B3組可明顯提升機體內IL-2含量，且其能較長時間維持在較高水平狀態。

3 小結與討論

IL-18是近年發現的一種細胞因子，具有促進T細胞增殖分化、誘生IFN-γ等生物學功能。由IFN-γ介導的非特異性免疫反應較體液免疫和細胞免疫早數小時至數天，能為抵御病毒侵害提供快速而強大抵抗力[14]；IFN-γ在機體內含量的高低預示著動物的免疫水平狀況。IL-2的主要作用是促進T、B淋巴細胞、NK細胞分化成熟并激活其生物學活性，比較IFN-α、IL-1α、IL-2和IFN-γ對疫苗的免疫增強作用，表明IL-2與IFN-γ的免疫增強效果較強[15]。

IL-18作為天然活性蛋白，克服了使用傳統藥物副作用大的缺點，是一種新型免疫增強劑。PHA和2-D-G也是常用的細胞因子誘生劑和抗病毒制劑，PHA可刺激T細胞增殖分化產生大量效應T細胞和細胞毒T細胞，效應T細胞分泌產生干擾素殺傷病毒，細胞毒T細胞可直接殺傷病毒；PHA同時可刺激B細胞轉化為漿母細胞然后增殖分化為漿細胞，漿細胞產生大量的非特異性抗體來中和病毒。2-D-G作為葡萄糖的異構體類似物，干擾病毒能量代謝，可用于禽類病毒病防治的輔助性藥物。由于PHA或2-D-G小劑量單獨使用效果不佳，增加劑量成本過高甚至產生毒副作用[16]，這就決定PHA和2-D-G常作為輔劑使用[10，17]。

本試驗利用不同劑量的重組雞IL-18菌體和純化蛋白與PHA最小有效量[10]和生產實踐中2-脫氧葡萄糖最小使用量進行組合，分別經消化道投送和注射途徑免疫，兩種途徑在免疫早期都能夠明顯提高雞體內IFN-γ和IL-2水平。利用菌體消化道投送，隨著IL-18菌體含量的增加，雞體內IFN-γ和IL-2的水平變化較小，維持的時間也相對較短。雖然目前對復雜蛋白原核表達產物活性存有爭議，但菌體消化道投送途徑表現出IL-18對雞體內IFN-γ和IL-2具有明顯的誘生作用。有資料表明[18]，在胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、枯否細胞和活化的巨噬細胞中均可檢測到IL-18的mRNA，但在小腸上皮細胞的胞質中有大量的IL-18，表明小腸上皮細胞可能是IL-18最主要的來源，并對IL-18具有翻譯后的加工能力。推測含IL-18的菌體在消化道被裂解后，菌體表達的IL-18可被小腸上皮細胞吸收并進行加工修飾而體現出免疫增強活性。

經注射途徑免疫，隨著IL-18蛋白含量的增加，雞體內IFN-γ和IL-2的水平隨之升高，試驗組組間差異明顯，且維持的時間相對較長，并且IFN-γ和IL-2表達峰值也較口服途徑稍高。表明增加IL-18蛋白含量，不但可進一步提升對雞體細胞因子的誘生作用，而且與PHA和2-D-G協同作用也更明顯。大腸桿菌表達的IL-18蛋白表現出的誘生活性，與雞體對重組IL-18蛋白的識別有關。

IL-18作為天然的免疫調節劑和疫苗免疫增強劑，本身無免疫原性，不會引起自身免疫疾病，與PHA和2-D-G聯合使用，克服了單獨使用成本高、副作用大等缺點，可作為一種新型復合免疫調節制劑。隨著研究的進一步深入，有望為新型免疫增強和抗病毒制劑的開發和應用提供新的思路。

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