正交試驗優選反枝莧總黃酮的提取工藝

摘要：為優選反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）中總黃酮的最佳提取工藝，試驗以蘆丁為標準品計算反枝莧中總黃酮的含量，通過正交試驗考察不同因素和水平對提取工藝的影響。結果表明，反枝莧中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度50%，料液比1∶15，水溶回流法提取3次，每次提取1.5 h。該工藝合理、簡單，適用于反枝莧總黃酮的提取，可為該資源的利用提供參考。

關鍵詞：反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）；總黃酮；正交試驗；提取工藝

中圖分類號：TQ28 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4748-03

反枝莧是莧科一年生植物反枝莧（Amaranthus retroflexus L.）的莖葉。現代醫學證實，反枝莧含有豐富的鐵、鈣、胡蘿卜素和維生素C，對青少年的生長發育和成人的身體健康都有幫助。反枝莧中沒有草酸，所含的鈣質很容易被人體吸收，而豐富的鐵可以合成細胞中的血紅蛋白，有造血和攜帶氧氣的作用，被譽為“補血菜”。反枝莧中含有多種氨基酸，尤其是含有人體所必需的賴氨酸，而玉米、小麥、大米等谷物中含量則較少，因此常吃嫩反枝莧對人體健康是很有益的。

中醫認為，反枝莧性涼，味甘，具有清熱明目、通利二便、收斂消腫、解毒止痢、抗炎止血等功效，可治療尿血、內痔出血、扁桃腺炎、急性腸炎等癥。

黃酮類化合物是存在于自然界中的一大類化合物，在食品和醫藥工業上有著廣泛的應用。本研究考察了乙醇濃度、提取時間、提取次數、料液比等因素對反枝莧中總黃酮提取率的影響，并以此4因素為指標設計正交試驗，優選反枝莧中總黃酮最佳提取工藝條件，為反枝莧的進一步深入開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 試驗用反枝莧于2011年10月采自重慶醫科大學藥物園（經鑒定為莧科反枝莧），粉碎，過篩，低溫密封干燥保存；蘆丁標準品：批號153184-201006（購自北京世紀奧科生物技術有限公司）；95%乙醇、無水甲醇、丙酮等均為分析純；蒸餾水為實驗室自制。

1.1.2 儀器與設備 UV765CRT型紫外可見分光光度計（上海圣科儀器設備有限公司）；AL204型分析天平（萬分之一）[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HH-6型恒溫數顯水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；SB-3200DTD型超聲波清洗機（上海茸研儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品20.0 mg，以95%乙醇溶解，搖勻，定容至100 mL容量瓶中使之濃度為0.2 mg/mL。準確移取蘆丁對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于25 mL容量瓶中，分別加水至6 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁1 mL，搖勻放置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，加95%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min。用紫外分光光度計在510 nm處測其吸光度（A），以吸光度（A）為縱坐標、蘆丁溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程為：y=1.893x+0.002 5，r=0.999 5。

1.2.2 提取方法對反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15（m/V，g/mL，下同），提取時間1.5 h，考察不同的提取方法（水浴回流法、水煮法、超聲波法）對反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.3 提取時間對反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15，水浴回流法提取3次，考察不同的提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0 h）對反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.4 提取溶劑對反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，分別用50%、70%乙醇、無水甲醇及丙酮水浴回流法提取3次，料液比均為1∶15，提取時間1.5 h，考察不同提取溶劑對反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.5 提取次數對反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶15，水浴回流法提取1.5 h，考察不同的提取次數（1、2、3、4次）對反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.6 料液比對反枝莧總黃酮提取率的影響 精密稱取反枝莧粉末2.0 g，以50%乙醇為提取溶劑，回流法提取2次，提取時間1.5 h，考察不同的料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）對反枝莧總黃酮提取率的影響。

1.2.7 正交試驗設計 根據反枝莧總黃酮提取率的影響因素[1-5]，設計了4因素3水平的正交試驗L9（43）。4個因素分別為提取時間（A）、乙醇濃度（B）、提取次數（C）、料液比（D）。正交試驗因素與水平見表1。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取方法對反枝莧總黃酮提取率的影響 3種提取方法下反枝莧總黃酮的提取率見表2。由表2可見，以水浴回流法提取時反枝莧總黃酮的提取率最高，達0.834%，超聲波法提取效果次之，水煮法提取效果最差。因此選擇水浴回流法為反枝莧總黃酮的提取方法。

2.1.2 提取時間對反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖1可見，反枝莧總黃酮的提取率隨提取時間的增加而增加，但提取時間增加到1.5 h后其提取率變化不大，故選擇提取時間為1.5 h。

2.1.3 提取溶劑對反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖2可見，不同濃度的乙醇溶液作提取溶劑時，反枝莧總黃酮的提取率均較高，所以最后選擇乙醇溶液為反枝莧總黃酮的提取溶劑。

2.1.4 提取次數對反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖3可見，反枝莧總黃酮提取率隨提取次數的增加而增加，但從節省溶劑和耗能角度考慮，選擇提取3次為宜。

2.1.5 料液比對反枝莧總黃酮提取率的影響 由圖4可見，溶劑用量對反枝莧總黃酮提取率有一定影響，增加溶劑用量有利于總黃酮的滲出，但溶劑用量過大，不僅增加溶劑消耗，而且會增加濃縮回收溶劑的耗能。綜合分析，選擇料液比1∶15為宜。

2.2 正交試驗結果

2.3 驗證試驗

準確稱取反枝莧粉末2.0 g，按上述最佳提取條件提取，所得反枝莧總黃酮提取率為1.349%，RSD=1.63%，表明該工藝重現性良好。

3 小結與討論

1）本試驗對蘆丁和反枝莧中提取的總黃酮的最大吸收波長進行了比較考察，將反枝莧按照上述最佳條件提取總黃酮后顯色，在400～600 nm下掃描，與蘆丁標準品的吸收曲線對比，發現最大吸收峰均在510 nm附近，說明本試驗選擇510 nm為檢測波長測定其吸光度并計算總黃酮含量的方法可取。

2）正交試驗表明，反枝莧中總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，提取時間為1.5 h，提取次數為3次。

3）試驗過程中發現，在測定反枝莧中總黃酮的時候，當往樣品液中加入氫氧化鈉溶液時會產生一些紅色結晶物，這種物質的存在是否會影響測定結果還有待進一步的研究。

4）反枝莧是一種分布廣泛的雜草，如何做到除草和利用的有機結合，本研究從反枝莧總黃酮含量測定及提取工藝研究方面做了有益的探索。

參考文獻：

[1] 張彩霞，董相軍，胡鳳祖.正交試驗優選珠芽蓼果實中總黃酮提取工藝[J]. 中國藥房，2008，19（3）：186-188.

[2] 曾超珍，呂清卿，趙 燕.枸骨葉總黃酮提取工藝研究[J].江蘇農業科學，2009（4）：321-323.

[3] 汪婷婷，吳士筠.正交試驗法優選藥用菊花的總黃酮提取工藝[J].化工技術與開發，2009，38（9）：23-25，61.

[4] 邱燕燕，牛泱平.狗舌草中總黃酮的提取工藝研究[J].浙江化工，2009，40（10）：5-7.

[5] 王 元，王學軍.正交試驗法優選沙棘葉總黃酮的提取條件[J].甘肅科技，2009，25（21）：159-160，210.