釀酒酵母ARS305側翼序列對其自主復制活性的影響

摘要：利用PCR技術擴增了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ號染色體上以ARS（Autonomously replicating sequence，ARS）305為核心的不同長度側翼序列，并將其構建到酵母整合型載體pRS405中獲得了重組質粒PA500、PA1000、PA2000，然后通過電轉化法轉入釀酒酵母細胞中，測定了不同ARS305片段對酵母轉化效率及質粒在酵母中穩定性。結果表明，并非側翼序列越長ARS活性越高，重組質粒PA1000具有比PA2000更高轉化頻率和轉化穩定性，推測ARS兩側序列存在一些順式和反式的調控機制影響ARS自主復制功能。

關鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ARS305；重組質粒；復制起始活性

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4804-03

真核生物染色體中存在多個復制起始位點，能夠使真核生物巨大的基因組在較短時間內完成復制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的復制起始位點稱為自主復制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在釀酒酵母的TRPI基因緊密連鎖DNA序列中發現，含有ARS的質粒轉化酵母后能獨立存在于宿主染色體外且能自主復制[1]。此后，Irene等[2]從釀酒酵母Ⅲ號染色體中共發現有19個ARS，約為150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面卻表現出明顯的差異，部分活性高的ARS卻沒有ACS保守序列[3]。說明DNA復制起始功能不僅由ACS保守序列決定，還需核心序列3′和5′側翼序列的參與。

在酵母遺傳工程中，不考慮載體-宿主系統的類型、外源基因產物的性質和工程菌的培養條件等因素，重組質粒的穩定性可以從功能上鑒定復制起始位點的活性。通過DNA重組技術將可能含有ARS的DNA片段構建到缺失復制起始位點的質粒后轉入細胞，如果它有較高的細胞轉化率并且表現為遺傳不穩定性，就表明該片段在宿主菌中可能有復制起始位點活性[4]。本研究擴增了以ARS305為核心的不同長度側翼序列，并將其構建到酵母整合型載體pRS405中，通過電轉化法轉入釀酒酵母細胞中，測定了不同ARS片段對酵母轉化效率及質粒在酵母中穩定性，為后續以酵母作為模式生物研究真核基因的復制與轉錄機制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 Esherichia coli DH5α為內蒙古科技大學生物工程與技術研究所基因工程實驗室保藏。釀酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型載體pRS405由美國新澤西州醫學院微生物學與分子遺傳學部Newlon教授饋贈。

1.1.2 試劑 DNA Marker，限制性內切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶及PCR產物純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；Agarose購自Invitrogen公司；PCR引物合成及DNA測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成；其他試劑藥品為進口分析純和生化試劑。

1.1.3 培養基 大腸桿菌的培養使用LB培養基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母浸提物5 g/L，固體培養基瓊脂含量15 g/L）；釀酒酵母YPH499的培養使用YPD培養基（胰蛋白胨20 g/L，酵母浸提物10 g/L，高壓滅菌20 min 后，加入100 mL滅菌的20 g/L葡萄糖溶液，固體培養基瓊脂含量15 g/L）。SD 篩選培養基（1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂）；氨基酸（20 mg/L Trp，20 mg/L His，20 mg/L Lys）。

1.2 方法

1.2.1 酵母基因組的提取 珠磨法提取：收集過夜培養16～18 h的釀酒酵母YPH499菌液，用TE洗滌2次溶于200 μL TE中；加入50 mg玻璃珠（直徑0.3～0.5 mm）和100 μL酚∶氯仿（25∶24，V/V），漩渦振蕩2～3 min；12 000 r/min離心2 min，取上清，加入等體積酚∶氯仿（25∶24，V/V），抽提后12 000 r/min離心5 min；取上清，加入0.5 μL RNaseA，37 ℃溫浴30 min；加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心5 min，沉淀物用70%乙醇洗2次，自然干燥后溶于20 μL TE，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ARS305側翼序列的擴增 根據GenBank中釀酒酵母Ⅲ號染色體上的ARS305序列，利用Primer premier 5.0軟件設計了3對特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 擴增反應體系總體積為 25 μL：模板DNA 2.0 μL、10×DNA Polymerse Buffer 2.5 μL、EX Taq DNA Polymerse（5 U/μL）0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 μL、引物F1和R2（10 mmol/L） 1.0 μL、ddH2O 16.0 μL。PCR反應后回收目的條帶，于-20 ℃保存備用。

1.2.3 酵母自主復制質粒的構建 采用限制性內切酶XhoⅠ（PstⅠ）和BamHⅠ雙酶切PCR擴增純化產物和整合型載體pRS405，分別回收目的片段和載體片段， 16 ℃條件下T4 DNA連接酶連接24 h，連接產物轉化至E. coli DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐抗性（50 μg/mL）的LB平板上，37 ℃過夜培養，提取質粒雙酶切鑒定陽性克隆，同法構建另外兩個重組質粒。

1.2.4 重組質粒的電轉化 將純化的質粒加入到 100 μL釀酒酵母YPH499感受態細胞中，輕柔混勻后移入預冷的2 mm電擊杯中。按照文獻[5]設置參數，電擊后迅速加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇緩沖液。28 ℃靜置復蘇 1～2 h后加入1 mL液體YPD培養基，于30 ℃、100 r/min下培養1 h。濃縮培養液，將其均勻涂布于含100 μg/mL亮氨酸的YPD平板上，30 ℃避光下培養，得到轉化子。再從酵母轉化子中提取質粒DNA，轉化入E. coli DH5α感受態細胞中，抽提質粒 DNA 并進行雙酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 ARS305側翼序列的擴增

PCR產物經 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后發現，所擴增片段分別為1 200、1 700、2 300 bp，與預期大小相符（圖1）。

2.2 酵母自主復制質粒的構建及檢測

酵母整合型質粒pRS405可以在大腸桿菌中復制，氨芐青霉素抗性基因可作為篩選標記。但它不能在酵母中復制，只有通過重組到酵母染色體上才能隨染色體的復制而復制。pRS405帶有LEU基因可作為在酵母LEU基因缺失株中的篩選標記。將擴增的目的片段插入到酶切的pRS405載體中以檢測ARS305側翼序列自主復制活性。挑取單菌落，接種于氨芐抗性液體培養基，37 ℃過夜培養，堿裂解法提取質粒。經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳結果與預期大小相符（圖2），表明成功構建了自我復制型載體PA500、PA1000、PA2000。

2.3 ARS功能質粒丟失率的測定

酵母轉化效率是鑒定自主復制活性強弱的直接指標。將質粒PA500、PA1000、PA2000定量轉化酵母。結果表明，盡管這些片段均有ARS活性，但酵母轉化效率存在一定差異，且質粒PA1000比PA2000有更高的轉化頻率。

由于含有 ARS 片段的質粒在酵母細胞內獨立復制，并非整合到酵母染色體上，所以在細胞分裂過程中，就存在質粒丟失問題。將含有質粒PA500、PA1000、PA2000的酵母于完全YPD培養基中經約8代培養（16 h），經計算質粒PA500每代的丟失率為16.2%，質粒PA1000 每代的丟失率為10.7%，質粒PA2000每代的丟失率為13.8%。這說明它們在酵母中都是不穩定的（表2）。

3 小結與討論

盡管真核生物的復制在進化中有很強的保守性，但不同物種的DNA復制起始位點之間卻缺少明顯的一致序列或結構。釀酒酵母的復制起始位點由11 bp的ACS保守序列和幾個輔助序列（B區）組成。ACS是復制起始識別蛋白ORC結合位點。ACS的側翼序列不保守，但其對ARS的活性卻是非常重要的[7]。

雖然在酵母中大多數ARS都有ACS，但其中有些位點的使用頻率比其他位點的更高，且有一些潛在的復制起始位點在正常生長條件下從不使用，而一旦這些潛在的復制起始位點序列克隆到質粒上，都能有效地作為復制起始位點行使其功能。因此，在酵母細胞核中染色體的環境諸如核小體定位、染色質修飾、ARS序列特征等能決定哪些潛在的位點被用作起始點以及使用的頻率。Theis等[3]研究發現當敲除Ⅲ號染色體上其他高活性ARS，ARS308復制起始活性大大增強。Eaton等[8]等利用高通量列分析測定了酵母體內ARS兩側的核小體定位圖譜，發現酵母復制起始位點ARS兩側核小體分布具有一定的規律，復制起始識別蛋白ORC的結合也需要ARS兩側精確的核小體定位。

本研究擴增了釀酒酵母Ⅲ號染色體有活性的ARS305及以ARS305為核心不同長度的側翼序列，并將目的片段構建到酵母整合型載體pRS405中獲得重組質粒PA500、PA1000、PA2000。酵母電轉化試驗發現ARS活性不僅受ACS元件控制，其旁側序列對其活性也有重要影響，且并非側翼序列越長活性越高（PA1000具有比PA2000更高轉化頻率和轉化穩定性），推測延長的1 000 bp序列為ARS305活性負調節元件，與相應的反式作用因子共同調控ARS305活性，因此ARS功能并不完全依賴于ACS和解鏈程度，可能涉及一些順式和反式的調控機制。

參考文獻：

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[2] IRENE C， MACLARLELLO C， NEWLON C S， et al. Identification of the sequences required for chromosomal replicator function in Kluyveromyces lactis[J]. Molecular Microbiology，2004，51（5）：1413-1423.

[3] THEIS J F， DERSHOWIZ A， IRENCE C， et al. Identification of mutations that decrease the stability of a fragment of Saccharomyces cerevisiae chromosome III lacking efficient replicators[J].Genetics，2007，177（3）：1445-1458.

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[8] EATON M L， GALANI K， KANG S， et al. Conserved nucleosome positioning defines replication origins[J]. Genes Development，2010，24（8）：748-753.