滅多威對MDEC—07114細胞周期及Cyclin—D1的影響

摘要：為探討滅多威對家蠅胚胎細胞系MDEC-07114細胞周期及細胞周期蛋白Cyclin-D1的影響，用流式細胞儀檢測不同濃度滅多威對MDEC-07114細胞周期的影響，應用免疫組化S-P法（Streptavidin-perosidase）檢測細胞周期蛋白Cyclin-D1表達。結果表明滅多威作用于MDEC-07114后，各濃度組G0/G1期升高，S+G2/M期細胞占比及PI降低；從滅多威1 mg/mL處理組開始Cyclin-D1表達出現降低，且隨濃度的增加降幅增大。可見滅多威可以通過下調Cyclin-D1使細胞周期阻滯而抑制細胞生長。

關鍵詞：MDEC-07114細胞；滅多威；細胞周期；Cyclin-D1

中圖分類號：Q965.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-4949-02

Effects of Methomyl on Cell Cycle and Cyclin-D1 of MDEC-07114 Cell

LIU Liu，HE Li-fang，LIU Hui，HUANG Xue-gui，ZHANG Xi

（Department of Parasitology， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）

Abstract： To investigate the effects of Methomyl on cell cycle and cyclin-D1 of MDEC-07114 Cell， experiments were conducted to measure the effects on cell cycle with flow cytometry and expression of cyclin-D with immunohistochemical S-P method. For the MDEC-07114 cell under Methomyl， the percentage of G0/G1 was increased while the percentage of S+G2/M and the cell proliferation index were obviously reduced at the all concentration-groups. From the 1mg/mL groups of Methomyl， the expression of cyclin-D1 was reduced with the increase of the concentration.Therefore， the growth of MDEC-07114 may be inhibited by reducing expression of cyclin-D1 to block cell cycle.

Key words： MDEC-07114 cell； Methomyl； cell cycle； Cyclin-D1

MDEC-07114是遵義醫學院寄生蟲學課題組自建的家蠅胚胎細胞系，滅多威為氨基甲酸酯類殺蟲劑，對昆蟲卵有殺傷作用，對家蠅也有毒殺作用，前期研究表明滅多威對體外培養的MDEC-07114細胞有抑殺作用[1]。家蠅抗藥性問題日趨嚴重，尋找新的殺蟲劑成為必然。昆蟲細胞凋亡的研究是探討昆蟲殺蟲劑作用機制、尋找昆蟲防治新途徑的探索和嘗試。細胞凋亡與細胞周期阻滯有關[2-4]。本試驗研究滅多威對MDEC-07114的細胞周期及細胞周期調控蛋白的影響，為新的昆蟲防治方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試細胞 家蠅胚胎細胞系MDEC-07114，由遵義醫學院寄生蟲學教研室提供。

1.1.2 滅多威溶液 滅多威[含量99.9%，批號BW（E）060546] 購自北京恒元啟天化工技術研究院，丙酮（分析純）購自成都化學試劑廠。先用無血M3培養基溶解丙酮，配制成1%丙酮溶液，抽濾，4 ℃保存。然后用1%丙酮溶液溶解滅多威，混勻抽濾配成20 mg/mL滅多威母液，4 ℃保存。使用時用1%丙酮溶液稀釋成不同濃度供試驗用。

1.1.3 碘化丙啶溶液 將碘化丙啶（美國Sigma公司生產）溶于PBS中，終濃度為100 mg/mL，含RNase 100 μg/mL，4 ℃避光保存。

1.1.4 免疫組化S-P法試劑 SP-0023免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、Anti-Cyclin D1均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.5 主要儀器 FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司生產），奧林巴斯-CX31顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社生產）。

1.2 方法

1.2.1 MDEC-07114細胞培養 取液氮凍存的MDEC-07114復蘇傳代培養，接種于一次性塑料培養瓶中，28 ℃、5% CO2孵箱中培養[5]。采用直接吹打法傳代，每隔3 d傳代一次，生長穩定后進行后續試驗。

1.2.2 試驗分組 試驗組，滅多威濃度分別為1、2、4 mg/mL；丙酮組，1%丙酮；正常組，作為對照，不加藥劑。3個平行。

1.2.3 細胞周期檢測 在塑料培養瓶中接種細胞懸液4 mL（每毫升細胞數為2×106個），28 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄上清液，加入含1%胎牛血清的培養基進行同步化處理，24 h后棄上清液，加含不同濃度滅多威的培養基繼續培養，正常組加等量的培養基，24 h后收集細胞，500 r/min離心5 min，PBS洗1次，離心棄上清液，PBS重懸細胞，400目尼龍網過濾，500 r/min離心5 min，棄PBS后加入碘化丙啶染液，4 ℃避光2 h后上機測各細胞周期細胞占比。根據所得的數值計算細胞的增殖指數（Proliferative index，PI）：

PI=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%。

1.2.4 免疫組化S-P法檢測Cyclin-D1 接種細胞于有蓋片（PLL包被）的6孔板中（細胞數為2×106個/mL，1 000 μL/孔），24 h后棄上清液，加入含有不同濃度滅多威的培養基，正常組加等量的培養基，同時設PBS組作為陰性對照組，各組設3個平行孔。培養24 h后取出蓋片，4%多聚甲醛固定后按照SP免疫組化染色試劑盒說明進行操作。

1.2.5 免疫組化結果分析 Cyclin-D1免疫組化以細胞核及胞漿出現棕黃色顆粒為陽性表達。每張玻片選擇10個視野進行圖像采集，采用IPWIN60軟件進行灰度分析，測定陽性染色面積（A）、平均光密度（M）以及積分光密度（IOD），以各組平均IOD值作為最終計算結果。

1.2.6 統計學處理 所有數據均用平均數±標準差（x±s）表示，數據用SPSS軟件處理，單因素方差分析，t檢驗，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 細胞周期測定

各處理的各細胞周期細胞占比及增殖指數見表1。滅多威1 mg/mL組、正常組以及丙酮組MDEC-07114的G0/G1期和S+G2/M期細胞占比均無顯著差異（P>0.05）。2 mg/mL組、4 mg/mL組MDEC-07114細胞G0/G1期細胞占比升高，S+G2/M期細胞占比降低，細胞增殖指數PI降低，3項指標與正常組比差異達顯著水平（P<0.05）。

2.2 Cyclin-D1表達

鏡下觀察可見，正常組中Cyclin-D1陽性表達細胞最多，顏色呈棕黃色。隨藥物濃度增加陽性表達細胞減少，顏色逐漸變淡。正常組細胞IOD值最高，從滅多威1 mg/mL組開始減少，隨藥物濃度的增加IOD值逐漸降低（表2），藥劑處理組與正常組的差異有統計學意義（P<0.05）。

在細胞周期中，至少有兩個節點控制細胞能否進入下一個時相，節點調控細胞周期的進展，與細胞周期阻滯有關。一個位于G1/S處，另一個位于G2/M處[6]。調節細胞周期的因子大致可分為細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑（CDI）[7]。Cyclin-D是果蠅中惟一的D型周期蛋白，推動細胞分裂[8]。哺乳動物的D型細胞周期蛋白有Cyclin-D1、Cyclin-D2、Cyclin-D3三種，Cyclin-D1可通過激活CDK4推動細胞周期從G1期進入S期[9]。

流式細胞檢測顯示，滅多威2、4 mg/mL組可引起MDEC-07114細胞G0/G1期占比升高，S+G2/M期占比降低，PI降低。提示滅多威可致MDEC-07114細胞的G0/G1期阻滯，細胞增殖受到影響。S-P法檢測結果顯示，從1 mg/mL組開始Cyclin-D1陽性表達細胞開始減少，隨藥物濃度增加陽性表達細胞逐漸減少，顏色逐漸變淡。隨藥物濃度的增加IOD也逐漸降低，滅多威作用于MDEC-07114細胞后，Cyclin-D1表達減少。Cyclin-D1是G1期細胞周期蛋白，在G1期存在并大量表達，當其表達減少，必然引起細胞周期的G1期阻滯，細胞生長受到影響。前期研究證實一定濃度的滅多威可以抑制MDEC-07114細胞生長，結合本研究推測，滅多威可能通過下調Cyclin-D1，使細胞周期阻滯而抑制MDEC-07114細胞生長，Cyclin-D1參與家蠅胚胎細胞周期調控。細胞周期阻滯與細胞凋亡相關，滅多威是否可以誘導MDEC-07114細胞凋亡有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 謝 偲，賀莉芳，劉 暉，等.滅多威對離體培養MDEC-07114細胞的抑制作用[J].安徽農業科學，2010，38（7）：3346-3349.

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