UPLC—MS / MS法檢測青蒿中青蒿素的含量

摘要：采用UPLC-MS/MS法檢測青蒿中青蒿素的含量，色譜柱Waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm），以甲醇和水梯度洗脫，甲醇-水體積比為40%（0 min）-70%（4.5 min）-40%（5.0 min）-40%（5.5 min），流速0.30 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量3.0 μL，離子模式（ESI+）分析，青蒿素母離子為m/z=283.3。子離子m/z=151.2，m/z=209.4。結(jié)果表明，在上述條件下，青蒿素與雜質(zhì)分離完全，無明顯干擾，檢出限達到0.174 ng，平均回收率為99.38%，精密度良好，青蒿中青蒿素含量為（1 045.19±27.55） mg/kg，該法適用于青蒿素分析。

關鍵詞：UPLC-MS/MS；青蒿；青蒿素

中圖分類號：O657.6；Q591.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5041-03

Detection of Artemisinin in Artemisia annua L. by UPLC-MS/MS

TENG Ming-gui1，XIE Cheng-cheng1，WANG Ye2，QIANG Yu-gang1，WANG Tao1，ZHAO Yang-yang1，

WANG Zhan-yong1，HOU Tian-gao2，JIANG Hai1

（1. School of Biological Science Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong 723000， Shaanxi， China；

2. Hanzhong Senior High School， Hanzhong 723000，Shaanxi， China）

Abstract： The detection of artemisinin in Artemisia annua L. was analysed by UPLC-MS/MS. The chromatographic column waters ACQUITY BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm） was used in the analysis. The elution program was 40% （methanol/water， V/V， 0 min）-70%（4.5 min）-40%（5 min）-40%（5.5 min）. The isolation was preformed with 0.3 mL/min at 30 ℃， and the injection volume was 3.0 μL in ESI（+） scan. The precursor ion of artemisinin was m/z=283.3， daughter ion were m/z=151.2，m/z=209.4. The results showed that artemisinin could be detected in these conditions. The detection limit was 0.174 ng with recovery of 99.38% and good precision. The content of artemisinin in Artemisia annua L. reached（1 045.19±27.55） mg/kg. It was suitable for detecting artemisinin in Artemisia annua L..

Key words： UPLC-MS/MS； Artemisia annua L.； artemisinin

青蒿（Artemisia annua L.），又名黃花蒿，菊科，一年生草本，高1.5 m，全株黃綠色，有濃烈揮發(fā)性香氣。氣香特異，味微苦，在全世界均有分布，其干燥地上部分具有清熱解暑、除蒸、截瘧等功效[1]，主要含有倍半萜、黃酮、香豆素等成分[2-4]。青蒿素（Artemisinin）是青蒿的主要有效成分，青篙素為青蒿中含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯藥物，具有解熱、免疫、抗瘧，抗菌，抗寄生蟲作用，是我國惟一得到國際承認的抗瘧藥物[5]。2011年9月，我國藥學家屠呦呦因創(chuàng)制青蒿素和雙氫青蒿素新型抗瘧藥獲得拉斯克獎[6]。另外，青蒿素在抗腫瘤、腫瘤輔助化療、矽肺治療等方面也有療效[7]。目前，青蒿素已引起國際上的高度重視，原料藥材已實現(xiàn)規(guī)范化栽培，因此準確測定青蒿中青篙素含量對青蒿選種培育、青蒿素藥物生產(chǎn)及其藥理藥效研究都具有重要意義。

目前，青蒿素的測定方法包括：重量法（中華人民共和國藥典）[1]，紫外分光光度法[8，9]，熒光分析法[10，11]，氣相色譜法[12]，超臨界色譜分析法[13]，高效液相色譜法[14]等。高效液相色譜法因重復性和穩(wěn)定性好已被廣泛應用。但另一方面，由于青蒿素是含過氧橋的倍半萜類化合物，紫外吸收較弱，采用液相分離，紫外檢測器定量分析較困難。因此如何改進液相色譜分析青蒿素成為當前研究的熱點。例如：柱前衍生法[15]，蒸發(fā)光法[16]以及液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[17]等均已有應用。本試驗采用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀，建立了一種快速有效的青蒿素分析方法，為開發(fā)青蒿提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

青蒿樣品于2012年5月采于重慶市酉陽縣青蒿種植基地，經(jīng)烘箱40 ℃烘干、粉碎，過60目分樣篩，備用。

ACQUITY UPLC超高效液相色譜（美國Waters公司）；ACQUITY TQD 三重四級桿質(zhì)譜儀（Waters公司）；水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；AUW220D電子天平（日本島津公司）；AUY220電子天平（日本島津公司）；SK1200H超聲波清洗機（無錫市興邦基業(yè)電子有限公司）等。

1.2 試劑

青蒿素（純度為99.8%，重慶華武制藥廠）；甲醇、丙酮（分析純，天津市登峰化學試劑廠）；去離子水（娃哈哈食品有限公司四川廣元分公司）；甲醇（色譜純，Burdick Jackson 公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.5 mm，1.9 μm）；流動相為甲醇和水，梯度洗脫，甲醇梯度程序為40%（0 min）-70%（4.5 min）-40%（5.0 min）-40%（5.5 min）；流速0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量3.0 μL；檢測時間6.0 min；

1.3.2 質(zhì)譜條件 毛細管電壓3.2 kV，錐孔電壓30 V，離子源溫度110 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，錐孔氣流量50 L/hr，脫溶劑氣流量800 L/h。離子化模式為大氣壓電噴霧離子源正離子模式，碰撞池電壓15 V，碰撞氬氣流速0.14 mL/min。采用多反應監(jiān)測（MRM），青蒿素母離子m/z=283.3，子離子m/z=151.2，m/z=209.4，見圖1。

1.3.3 標準品溶液 精確稱取青蒿素標準品3.63 mg，甲醇溶解并定容至25.0 mL，得0.145 mg/mL標準對照母液。分別取標準母液0.1～2.5 mL于10.0 mL容量瓶中，甲醇定容，得1.45，2.90，7.25，11.6，14.5，

29.0，36.25 μg/mL標準工作溶液。

1.3.4 標準曲線繪制 取青蒿素標準工作溶液，過0.22 μm濾膜過濾，在設定條件下，各濃度溶液進樣3.0 μL，每濃度重復進樣3次，以標準溶液濃度為橫坐標，色譜-質(zhì)譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.3.5 定量限試驗 將青蒿素1.45 μg/mL的標準溶液逐級稀釋，色譜分析后，以S/N=10確定青蒿素的定量限。

1.3.6 樣品溶液制備 稱取青蒿樣品0.5 g于100.0 mL的圓底燒瓶中，量取25.0 mL丙酮，室溫超聲提取30 min，常壓過濾；揮干濾液，殘渣用甲醇溶液定容于25.0 mL容量瓶中，過0.22 μm有機微孔濾膜后備用，平行測試5份，分析青蒿樣品中青蒿素的含量。

1.3.7 方法學考察 在上述條件下，連續(xù)重復進青蒿素標準溶液5次，每次進樣3.0 μL，計算青蒿素峰面積的RSD值，考察方法的精密度；取樣品溶液，放置不同時間（0～24 h），在色譜-質(zhì)譜分析條件下進樣分析，每次進樣3.0 μL，計算青蒿素在不同放置時間內(nèi)峰面積的RSD值，考察方法的穩(wěn)定性；平行取青蒿樣品5份，制備樣品溶液后，進樣3.0 μL分析青蒿素的RSD值，考察方法的重復性；在已測定青蒿素含量為1 131.25 μg/g的樣品中加入435.0 μg的青蒿素標準品，同上法處理和分析，平行測定5份，計算青蒿素的回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

在該色譜-質(zhì)譜條件下的分離色譜圖見圖2，以青蒿素的峰面積為縱坐標，濃度（單位：μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得到青蒿素線性方程為y=495.58x+43.25，R2=0.998 6，青蒿素在4.35～108.75 ng之間線性范圍良好。

2.2 方法學考察結(jié)果

在上述色譜和質(zhì)譜條件下，在S/N=10時，計算得青蒿素的定量檢測限為0.174 ng。精密度試驗結(jié)果表明，測定得到青蒿素峰面積分別為3 640.67、

3 595.25、3 685.21、3 487.64、3 637.36，RSD=2.08%（n=5），RSD小于3%，表明精密度良好；穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，樣品中青蒿素在0、4、8、12、24 h的峰面積分別為9 878.63、10 255.28、9 933.54、9 864.82、

10 105.37、RSD=1.68（n=5），即樣品穩(wěn)定性良好；重復性試驗結(jié)果表明，樣品中青蒿素的峰面積分別為10 135.12、9 976.38、9 954.88、10 179.75、10 436.37，

RSD=1.91%（n=5），即本方法的重復性良好；青蒿中青蒿素的回收率見表1。由表1可知，平均回收率為99.38%，RSD=1.90%，表明該分析方法的準確度較高，能滿足分析要求，結(jié)果準確可靠。

2.3 樣品分析結(jié)果

按照上述方法處理和分析青蒿樣品，樣品中的青蒿素含量見表2，樣品色譜圖見圖3。

由表2可知，酉陽縣青蒿中的青蒿素含量為0.11%，與北方地區(qū)報道的青蒿中青蒿素含量相當[18]，與酉陽報道的9月采收的青蒿青蒿素含量差異較大（重慶酉陽青蒿素7.08 μg/g）[15]，這可能與青蒿生長時間較短，青蒿素累積不足有關。

3 討論

通過分析青蒿中的青蒿素含量，可指導青蒿采收時間，控制青蒿素的生產(chǎn)。現(xiàn)有的Davis法、分光光度法、薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）存在操作繁瑣，靈敏度，準確度低等問題。采用UPLC分析能顯著提高分析效率，但采用UPLC連接PDA檢測器分析時，發(fā)現(xiàn)青蒿素的檢測靈敏度很低，同時待檢物的波長不穩(wěn)定，主要原因是青蒿素是具有過氧橋的倍半萜類化合物，對紫外無明顯吸收[15]，如采用紫外檢測器分析，需要對樣品進行柱前衍生，然后采用UPLC-MS/MS分析，檢測時間短，靈敏度，精密度，準確度都提高。酉陽縣5月采收的青蒿中青蒿素含量與報道的北方地區(qū)的青蒿中青蒿素的含量相當，與張偉等[15]報道的酉陽縣9月青蒿中青蒿素和劉金磊等[19]報道的廣西青蒿中青蒿素含量差異較大，這可能與青蒿中青蒿素的累積規(guī)律和產(chǎn)地差異有關，后續(xù)研究將針對酉陽縣不同采收期青蒿進行測定，摸索酉陽地區(qū)青蒿中青蒿素的累積規(guī)律，為青蒿產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)參考。

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