大蒜提取物對結(jié)核分枝桿菌基因表達(dá)變化的影響

鐘英英a，葉 云a，李乃雄b，譚江志a

（廣西工學(xué)院，a.生物與化學(xué)工程學(xué)院；b.理學(xué)院，廣西 柳州 545006）

摘要：通過歸一化對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，采用兩樣本非配對t檢驗，比較了2、5和10 μg/mL的大蒜（Allium sativum L.）提取物處理結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）后對其基因表達(dá)變化的影響。結(jié)果表明，5和10 μg/mL的大蒜提取物處理后獲得共同差異基因17個，與氧化應(yīng)激、蛋白損傷等生物學(xué)功能相關(guān)。大蒜提取物可能通過上述基因的調(diào)控起到抑制結(jié)核分枝桿菌的作用。

關(guān)鍵詞：大蒜（Allium sativum L.）提取物；結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；基因芯片；氧化應(yīng)激

中圖分類號：S633.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5054-03

Effect of Garlic Extract on Gene Expression in Mycobacterium tuberculosis

ZHONG Ying-yinga，YE Yuna，LI Nai-xiongb，TAN Jiang-zhia

（a.School of Biological and Chemical Engineering；b.College of Science， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： To investigate the effect of garlic（Allium sativum L.） extract on changes of gene expression in Mycobacterium tuberculosis， gene profile was analyzed. Quality of microarray data was controlled by normalization. The difference between treated with garlic extract and control in Mycobacterium tuberculosis was compared by two sample non-paired t-test. The results showed that 17 differential genes were overlapped in the treatment with 5 and 10 μg/mL garlic extract. These genes are related with oxidative stress and protein damage. Therefore， garlic extract may inhibit the Mycobacterium tuberculosis by regulating the expression of these differential genes.

Key words： garlic（Allium sativum L.）extract； Mycobacterium tuberculosis； gene chips； oxidative stress

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。盡管國際上針對結(jié)核分枝桿菌已開發(fā)出近20種藥物，但其副作用大，尤其對肝腎的毒副作用較大，易產(chǎn)生耐藥性。近年來耐藥及多重耐藥菌株（Multiple drugs resistant-bacilus tuberculosis，MDR-TB）的出現(xiàn)，更是對現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物提出了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。因此，從天然藥物中尋找安全有效的抗結(jié)核藥物，具有重要的意義[1，2]。

大蒜（Allium sativum L.）提取物具有廣譜的抗菌活性，對常見的細(xì)菌均有較好的抗菌作用。研究表明大蒜素對結(jié)核分枝桿菌具有很強(qiáng)的殺菌和抑菌作用[3，4]，而且大蒜素為常用的調(diào)味劑，無明顯的毒副作用。因此對那些肝功能異常，多種抗結(jié)核藥物不能使用及耐藥性的結(jié)核病人，大蒜素不失為一個較好的選擇[5]。然而目前大蒜素作用于結(jié)核分枝桿菌的研究大多還停留在抑菌效果的觀察方面，對其抑菌的分子機(jī)理仍然不夠清楚，結(jié)合基因芯片技術(shù)對大蒜提取物處理結(jié)核分枝桿菌的基因組進(jìn)行分析，探討其作用的分子機(jī)制，有利于從天然產(chǎn)物資源中尋找并開發(fā)有效的抗結(jié)核藥物。本研究通過歸一化對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，采用兩樣本非配對t檢驗，比較了2、5和10 μg/mL的大蒜提取物處理后對結(jié)核分枝桿菌的基因表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)

基因芯片數(shù)據(jù)GSE17640來源于GEO（Gene expression omnibus）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）公共數(shù)據(jù)庫，是4個雙通道芯片樣本[6]，芯片平臺為非商業(yè)化的GPL9036（SMD Print_1651 Mycobacterium tuberculosis）。

1.2 芯片制作

結(jié)核分枝桿菌H37Rv （ATCC 27294）在37 ℃下用米德爾7H9培養(yǎng)基（包含0.2%甘油、0.5%BSA fraction V、0.05%吐溫-80、0.08%NaCl和0.2%葡萄糖）培養(yǎng)至OD650 nm等于0.3（2～3 h）時，用2、5和10 μg/mL的大蒜提取物處理6 h后提取RNA，對照組則用等量的二甲基亞砜處理6 h后提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后分別合成標(biāo)記cDNA制作芯片。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載芯片數(shù)據(jù)的原始文件GSM440246、GSM440247、GSM440248、GSM440249分別解壓縮之后，去除每組數(shù)據(jù)表頭的注釋信息，僅留有基因名稱（Gene ID）和表達(dá)值（MEAN），即CH1I_MEAN，CH2I_MEAN，并將其分別對應(yīng)于對照和處理，制成一個樣本表達(dá)值的文本文檔。

使用統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理。首先采用justvsn方法進(jìn)行歸一化處理，通過生成箱式圖檢驗歸一化效果。然后，將表達(dá)值數(shù)據(jù)進(jìn)行以2為底的對數(shù)轉(zhuǎn)換，用SAM（Significance analysis of microarrays）方法進(jìn)行兩樣本非配對t檢驗，用以篩選經(jīng)大蒜提取物處理組和對照組的結(jié)核分枝桿菌差異基因，排列組合（permutation）次數(shù)設(shè)為1 000次，P值設(shè)定為0.05，假陽性發(fā)現(xiàn)率（FDR）小于0.01。通過NCBI數(shù)據(jù)庫對獲得的差異基因進(jìn)行注釋，同時對差異基因本體（Gene ontology，GO）實施分析，以找到這些基因?qū)?yīng)的生物學(xué)功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)處理的質(zhì)量控制

芯片數(shù)據(jù)歸一化結(jié)果的箱式圖如圖1所示。縱軸是數(shù)據(jù)值，橫軸是芯片數(shù)據(jù)集中的樣本名稱，共8個樣本。每一個樣本用一個方框表示，框中間的橫線表示數(shù)據(jù)的中位值。經(jīng)過歸一化后樣本數(shù)據(jù)的中位值基本相等，有效地消除或降低了樣本和芯片造成的系統(tǒng)偏差，從而有利于發(fā)現(xiàn)更有意義的生物學(xué)信息。

2.2 差異基因的獲得

將結(jié)核分枝桿菌芯片樣本分為兩組：對照組和大蒜提取物處理組。5、10 μg/mL大蒜提取物處理組獲得倍數(shù)變化為2倍以上的基因分別為56個和101個，將這些差異基因進(jìn)行交集共獲得17個共同的差異表達(dá)基因，有部分為功能未知基因，功能已知的有trxB2、trxC、clpB、sigH、dnaJ、dnaK、Hsp、Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334和Rv1335等，這12個基因經(jīng)大蒜提取物處理后在結(jié)核分枝桿菌中表達(dá)上調(diào)，而deoD、sigB、ptpA、Rv2111c和esxA等5個基因則表達(dá)下調(diào)。

2.3 差異基因的功能注釋

通過NCBI數(shù)據(jù)庫對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)上調(diào)基因主要與熱激反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白損傷等生物學(xué)功能相關(guān)。其中，trxB2、trxC與硫氧還蛋白系統(tǒng)的組分有關(guān)，即受蛋白質(zhì)損傷的影響較大；而Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334、Rv1335、clpB、 sigH、dnaJ、dnaK和hsp與熱激反應(yīng)有關(guān)。下調(diào)基因中Rv2111c和esxA功能未知，deoD、sigB則與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

差異基因的GO分析表明，上調(diào)基因主要參與了生物過程中的化學(xué)刺激的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和活性氧物種反應(yīng)等。如clpB、Rv346、dnaK和Hsp是細(xì)胞中膜和質(zhì)膜等結(jié)構(gòu)的主要組分，dnaK和Hsp應(yīng)對在生物過程中各類應(yīng)激反應(yīng)。

3 小結(jié)與討論

由于基因芯片技術(shù)只是一種半定量的分析手段，存在一定的誤差。因此，基因芯片數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性直接影響到后期的分析，因此如何獲得高質(zhì)量的基因芯片數(shù)據(jù)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。基于上述原因，在數(shù)據(jù)處理的前期先經(jīng)過芯片數(shù)據(jù)歸一化等質(zhì)量控制的手段，盡可能消除由于數(shù)據(jù)偏差帶來的試驗誤差，獲得更為準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

大蒜是一種藥食兩用的食品，大蒜提取物的主要成分為大蒜素。體外抑菌試驗結(jié)果表明，高濃度大蒜素對結(jié)核分枝桿菌具有很強(qiáng)的殺菌和抑菌作用，機(jī)制可能是大蒜素分子中的氧原子與細(xì)菌生長繁殖所必須的半胱氨酸分子中的巰基結(jié)合，能抑制結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的合成，同時抑制細(xì)菌旋轉(zhuǎn)酶而使DNA復(fù)制受阻、降解而致結(jié)核分枝桿菌死亡[8]。本研究通過基因芯片的表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)低濃度的大蒜提取物處理對結(jié)核分枝桿菌也有影響，會導(dǎo)致部分熱激反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及蛋白損傷相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而一些與轉(zhuǎn)錄及翻譯相關(guān)的基因則表達(dá)下調(diào)，表明DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)活動受到了一定的抑制。

氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個重要因素。氧化應(yīng)激起源于反應(yīng)性的氧化物與生物抗氧化劑間平衡的破壞，造成活性氧濃度升高，過多的自由基會引起毒性作用。因此，氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌生物膜脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性，核酸和染色體被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。有研究表明，在細(xì)菌衰老過程中，轉(zhuǎn)錄錯誤或翻譯錯誤會導(dǎo)致部分異常多肽的輕微錯誤折疊，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水表面的增加，從而使得DnaK/DnaJ的伴侶蛋白系統(tǒng)的作用位點增加，進(jìn)一步增加蛋白質(zhì)氧化作用的敏感性和蛋白質(zhì)錯誤折疊[10]。在分析基因芯片數(shù)據(jù)的過程中，也發(fā)現(xiàn)trxB2、trxC、dnaJ和dnaK等與蛋白損傷相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，其中dnaJ和dnaK表達(dá)上調(diào)這可能是由于結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過大蒜提取物處理后受到自由基的攻擊，導(dǎo)致蛋白損傷，從而降低或失去原有蛋白質(zhì)的功能，加速細(xì)胞衰老。另外，經(jīng)過大蒜油的處理也會使得結(jié)核分枝桿菌的Rv0331，Rv3463，Rv3054c，Rv1334和Rv1335等基因表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）并在其體內(nèi)迅速積累，導(dǎo)致相關(guān)蛋白折疊、正常的蛋白合成受到抑制、細(xì)胞內(nèi)分配及降解；還會對胞內(nèi)酶造成破壞，細(xì)胞正常的代謝受阻，導(dǎo)致生長發(fā)育終止或者引起細(xì)胞死亡[11]。

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