紫莖澤蘭葉第四級提取物治療雞球蟲病的研究

摘要：選擇健康、體重相近的25日齡鐵腳麻雞30只隨機分為3組，第1組不作處理（空白對照組），第2、3組滴喂球蟲孢子，3 d后第2組投喂地克珠利，第3組投喂紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）第四級提取物，7 d后試驗結束，分別計算藥物抗球蟲指數，測定小雞血液丙氨酸氨基轉移酶活性。此外，用質譜、紅外光譜、核磁共振等測定試驗藥物分子結構。結果表明，第3組抗球蟲指數為188.67，療效達到高效。試驗藥物組的丙氨酸氨基轉移酶活性平均值為99.88，低于空白對照組的，除腸道外其他器官未見異常癥狀，說明試驗藥物具有一定的毒性，但對雞的毒副作用較小。分子結構測定表明試驗藥物為含有苯胺和氯的結構復雜的脂類。

關鍵詞：紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）；提取物；治療；雞球蟲病

中圖分類號：S859 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5525-03

雞球蟲病是雞常見且危害十分嚴重的寄生蟲病，是一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病。球蟲的抗藥變異性強，目前所用的抗球蟲藥物幾乎都已出現抗藥蟲株[1]，如今即使在用藥情況下仍可暴發球蟲病或出現亞臨床感染情況[2，3]，給養雞業造成很大損失[4-6]。紫莖澤蘭（Eupatorium adenophorum）是外來入侵植物，對動植物均有危害，難以防治[7]，已在中國南方地區廣泛蔓延[8，9]，對生態系統造成嚴重破壞[10]，已被國家環保總局列為外來有害物種[11]。為了開發利用紫莖澤蘭，本研究用其葉的第四級提取物進行雞球蟲病的治療試驗，探究紫莖澤蘭毒素對雞球蟲的抑制能力，既為治療雞球蟲病尋找新藥物，也為紫莖澤蘭的利用探索新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

紫莖澤蘭鮮葉采自野生植株；含球蟲卵囊雞糞采自暴發球蟲病的養雞場；試驗動物為25日齡鐵腳麻雞。

主要試劑：異丙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙醇、2.5%重鉻酸鉀溶液、生理鹽水、硅膠（200～300目）、抗球蟲藥物地克珠利、丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒、肝素。

主要儀器：干燥箱、旋轉蒸發儀、培養箱、離心機、顯微鏡、微量移液器、色譜柱管、電子天平、半自動生化分析儀。

1.2 方法

1.2.1 紫莖澤蘭第四級提取物的制備 將紫莖澤蘭鮮葉置干燥箱內于65 ℃中烘干，粉碎后于試劑瓶中用異丙醇浸泡5 d，過濾，用旋轉蒸發儀濃縮濾液。用硅膠柱層析法對濃縮液進行組分分離，各級洗脫液為：石油醚、石油醚︰乙酸乙酯（分5級：3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶乙醇（分3級：2∶1、1∶1、1∶2）、乙醇。用旋轉蒸發儀把第四級組分的洗脫液蒸發后所得即為紫莖澤蘭第四級提取物。

1.2.2 球蟲孢子囊的獲取 將球蟲病患雞糞便放入清水中攪成懸液后用棉布過濾，濾液經離心（3 000 r/min，10 min）后棄去上清液，加清水把沉淀物攪溶后再離心，重復上述操作3次，棄去上清液后得到球蟲卵囊（含多種球蟲的）。將球蟲卵囊放入2.5%重鉻酸鉀溶液中于29 ℃中培養5 d，顯微鏡下觀察， 確認卵囊孵化為孢子囊后將培養液離心， 棄去上清液后加清水洗滌離心3次，棄去上清液， 加入適量生理鹽水得球蟲孢子囊懸液。用微量移液器吸取2 μL該懸液于載玻片上，顯微鏡下計數孢子囊數量，重復3次，用3次的平均數算出1 mL懸液中孢子囊的數量。

1.2.3 試驗分組及處理 25日齡鐵腳麻雞購進后觀察2 d，淘汰特小個體，隨機分為3組，第1組為空白對照組，第2組為對照藥物（地克珠利組），第3組為試驗藥物組（紫莖澤蘭葉第四級提取物組），每組10只，分別稱重。給第2、3組試驗雞滴喂球蟲孢子，每只的滴喂量為2萬～4萬個（根據上述計數結果確定懸液滴喂量），空白對照組不作處理。接種球蟲3 d后， 取血便于顯微鏡下檢查， 確認各試驗組雞患球蟲病后給第2組投喂濃度為0.15 mL/L地克珠利水溶液，劑量按說明書使用，第3組投喂紫莖澤蘭第四級提取物，用量為0.5 g/kg拌料使用。試驗期間正常管理，投藥7 d后將各組雞分別稱重、抽血、屠宰、解剖。

1.2.4 抗球蟲效果評判

1）相對增重率。相對增重率（%）=藥物試驗組的平均增重/空白對照組的平均增重×100

2）存活率。存活率（%）=每組終末存活數/每組初始雞只數×100

3）病變值。先根據病變的嚴重程度，用Johnson標準進行病變記分[12]，具體記分方法為：腸道壁無肉眼可見病變者記為0分；腸道壁有少量散在的淤血點、腸道壁不增厚，內容物正常者記為1分；腸道壁有較多的淤血點、腸道內容物明顯帶血、腸道壁增厚、盲腸內容物正常者記為2分；腸道有較多血液或有盲腸芯（血凝塊或灰白色干酪樣塊狀物）、腸道壁明顯增厚者記為3分；腸道充滿大量血液或盲腸芯很大，致使盲腸腫大或死亡者記為4分。對每只雞分別記分后算出各組的平均病變記分，再按下式計算每組病變值。

病變值=組內平均病變記分×10

4）平均卵囊值。取1 g腸道內容物于10 mL水中，充分攪拌成懸液后用微量移液器吸取2 μL于載玻片上，顯微鏡下計數卵囊數量，重復3次，用3次的平均數算出1 g腸道內容物中的卵囊數，按下式算出克卵囊數（Oocyst pergram，OPG）：

克卵囊數=1 g腸道內容物的卵囊數×10-6

當0≤OPG<0.1時，卵囊值0；當0.1≤OPG<1時，卵囊值1；當1≤OPG<6時，卵囊值10；當6≤OPG<11時，卵囊值20；當OPG≥11時，卵囊值40。每雞單獨計算，再算出各組的平均卵囊值。

5）判定標準。用抗球蟲指數（Anticoccidial Index，ACI）作為判定藥效的指標，按以下方法計算藥物的抗球蟲指數[12]。

抗球蟲指數（ACI）=（相對增重率+存活率）-（病變值+平均卵囊值）

藥效判定標準為：ACI≥180者為高效；180> ACI≥160者為中效；160>ACI≥120者為低效；ACI <120者為無效。

1.2.5 試驗藥物毒性測定 以試驗雞血液中丙氨酸氨基轉移酶活性的高低（與空白對照組相比）作為藥物毒性大小的指標。屠宰前對雞進行采血，每只采血10 mL，置于盛有肝素的試管中，輕微振蕩2 min后離心（2 000 r/min，10 min），取上清液，加入丙氨酸氨基轉移酶（ALT）測定試劑，充分反應后用半自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶活性（以吸光度來表示，吸光度越大，活性越大）。此外，通過解剖觀察，了解試驗雞各器官組織的病變情況，以此判斷試驗藥物毒性的大小。

1.2.6 試驗藥物分子結構測定 取試驗藥物樣品進行質譜（MS）、紅外光譜（IR）、核磁共振（NMR）H譜和C譜測定，通過測定了解其分子結構。

2 結果與分析

2.1 紫莖澤蘭葉第四級提取物的療效

由表1可知，即使受到球蟲的嚴重感染，第3組的相對增重率仍達91.67%，存活率為100%，這表明紫莖澤蘭葉第四級提取物對球蟲具有明顯的抑制作用。

2.2 紫莖澤蘭葉第四級提取物對丙氨酸氨基轉移酶活性的影響

各組小雞血液丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性的測定結果見表2。由表2可知，ALT易被有毒物質破壞，濃度下降，活性降低。第3組ALT活性明顯低于第1組，這表明紫莖澤蘭葉第四級提取物對試驗雞有一定的毒性。

2.3 試驗藥物分子結構

試驗藥物的分子結構是由中國科學院昆明植物所植化分析測試中心進行測定，測定結果見圖1。

3 小結與討論

3.1 紫莖澤蘭葉第四級提取物的療效

從表1可知，第3組的抗球蟲指數略高于第2組，療效達高效，這表明試驗藥物具有較強的抗球蟲作用。從試驗過程中試驗動物的病情變化來看，投喂藥物后的第二天小雞血便現象消失，這也表明試驗藥物對雞球蟲有較強的抑制作用。

3.2 紫莖澤蘭葉第四級提取物的毒性

由表2可知，第3組的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性比第1組低35.98%，比第2組低8.84%，從表1可知，第3組的相對增重率小于第2組，但第3組的病變值也小于第2組，說明紫莖澤蘭葉第四級提取物對試驗雞的毒副作用比地克珠利大，其抗球蟲能力也比地克珠利強。從解剖觀察結果來看，紫莖澤蘭葉第四級提取物的毒性較小，其毒副作用在試驗雞的耐受范圍之內。

3.3 試驗藥物的分子結構

從圖1可知，紫莖澤蘭葉第四級提取物為含有苯胺和氯的結構復雜的脂類，因條件所限，本研究未對其抑制球蟲的作用機理進行研究，僅測定了其分子結構，該測定結果可為紫莖澤蘭進一步開發利用的研究提供基礎資料。

綜上所述，從紫莖澤蘭葉第四級提取物對雞球蟲具有較強的抑制作用，對雞球蟲病的療效略優于高效抗球蟲藥物地克珠利，其毒性雖稍大于地克珠利，但對試驗雞的毒副作用較輕，未對小雞機體造成大的損害。

致謝：本試驗得到云南省森林災害預警與控制重點實驗室的鼎力支持，在此表示感謝。

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（責任編輯 程碧軍）