一株無毒力鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

摘要：從湖北某地淘汰鴨的腦組織分離到一株短桿菌，命名為JLLY，經分離培養、形態學檢查、生理生化試驗、PCR鑒定及測序結果的分析，分離菌株被鑒定為鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）。在毒力測定試驗中，將不同濃度的菌液腿部肌肉注射5日齡健康雛鴨。結果顯示，分離株JLLY注射的試驗動物無一死亡，可確定為無毒力。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）；分離鑒定；毒力試驗

中圖分類號：S852.61 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5539-02

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）病是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種細菌性傳染病，又稱鴨傳染性漿膜炎[1]，是主要侵害2～8周齡雛鴨的一種高致病性接觸性傳染病，目前已成為危害養鴨業的主要病原之一[2]；該菌主要侵害雛鴨，很多報道也都是從發病雛鴨中分離到該菌[3，4]，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室從某鴨場淘汰的400多日齡種鴨腦組織分離到一株鴨疫里默氏桿菌，在毒力鑒定試驗中發現為無致病性的菌株，現將相關研究報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

TSA、TSB培養基（BD公司）；無支原體胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；PT-2000 PCR儀、Model 3000Xi電泳儀（BioBAD公司）；Agarose Gel DNA Extraction Kit、瓊脂糖（OMEGA公司）。

1.2 試驗動物

1日齡的麻鴨，購自湖北某鴨場，飼養到5日齡確認健康。

1.3 細菌的分離

在無菌條件下，打開淘汰蛋鴨腦部，用接種環化線接種于含5%胎牛血清的TSA平板，37 ℃燭缸培養18 h，進一步挑取疑似菌落進行純化培養。

1.4 分離菌株的鑒定

1.4.1 形態及染色特性 將純化培養的疑似菌株進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察細菌的形態和染色特性。

1.4.2 生理生化試驗 挑取典型菌落接種于含有5%胎牛血清的TSB培養基中，37 ℃搖床培養18～24 h，取少量菌液滴加到H2S、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、觸酶、半固體瓊脂、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉子糖、山梨醇、側金盞花醇、木糖等16種細菌生化鑒定管中，置于37 ℃恒溫培養箱中培養，按照所購鑒定管的說明書操作，觀察細菌的生化特性。

1.4.3 PCR鑒定及產物純化 根據文獻[5]的RA 16S rRNA基因序列，合成引物P1、P2，目的片段為662 bp。上游引物（P1）：5′-CAGCTTAACTGTAGAA

CTGC-3′，下游引物（P2）：5′-TCGAGATTTGCATCA

CTTCG-3′，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR反應體系為：5 μL 10×buffer（含Mg2+），2 μL dNTPs，1 μL上游引物，1 μL下游引物，2 μL模板，0.5 μL Taq酶， 17.0 μL H2O；反應條件：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后，切下目的片段，用Agarose Gel DNA Extraction Kit純化回收DNA。

1.4.4 測序與序列分析 擴增出的目的基因片段回收后送往北京英駿公司測序。測序結果用BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在線進行同源搜索。

1.4.5 毒力測定 將分離的純化菌株挑單個菌落接種到TSB（含2%犢牛血清）上，37 ℃振蕩培養18 h，然后10倍數量級倍比稀釋后每個稀釋度涂布3個平板做細菌計數。然后用無菌生理鹽水，將菌液稀釋至1×1010、1×109、1×108、1×107 CFU/mL 4個稀釋度，每個稀釋度腿部肌肉多點注射0.5 mL；以RAXY強毒株（本實驗室分離保存）為陽性對照，用無菌生理鹽水將菌液稀釋至1×109、1×108、1×107、1×106 CFU/mL；生理鹽水作空白對照，接種后每天觀察數次，連續觀察7 d，記錄各組雛鴨的發病、死亡情況。

2 結果與分析

2.1 細菌分離鑒定及革蘭氏染色

經37 ℃燭缸培養18 h后，TSA固體培養基上長出白色凸起的圓形小菌落，對著光線可見菌落為透明且有特殊折射光。純培養物經革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌。

2.2 生理生化特性

純化菌株不能發酵各種糖類，枸櫞酸鹽和觸酶陽性，具體結果見表1。

2.3 PCR鑒定結果

JLLY菌株進行PCR擴增后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，出現660 bp左右的目的片段（圖1）。

2.4 序列測定及分析

將PCR擴增產物的測序結果經BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在線進行同源搜索，結果表明，JLLY菌株的16S rRNA序列與已報道的鴨疫里默氏桿菌同源度高達99%以上，證實該分離株為鴨疫里默氏桿菌。

2.5 分離菌株JLLY的毒力

連續觀察7 d，其中JLLY菌株攻毒的試驗組4個稀釋度從細菌原液1×1010 CFU/mL到稀釋至1×107 CFU/mL肌肉注射的5日齡健康麻鴨，無一死亡并且無發病癥狀，說明JLLY菌株的半數致死量（LD50）大于1×1010 CFU/mL；陽性對照組RAXY強毒株的4個稀釋度的雛鴨均發病，陸續死亡；空白對照組無一死亡。

3 小結與討論

目前，鴨疫里默氏桿菌是造成養鴨業經濟損失最主要的傳染病之一，血清型之多，地域分布之廣、且對藥物治療極易產生耐藥性，使得該病的防制工作相當困難[6]。該菌大多是從發病雛鴨中分離得到，而本實驗室從400多日齡的淘汰鴨中分離的JLLY菌株從形態學、革蘭氏染色、生理生化分析、PCR鑒定等各方面試驗證實為鴨疫里默氏桿菌，并且毒力試驗證實為天然弱毒株，比較罕見。

要很好地預防和控制該病就需要尋找病原菌的一些毒力因子，研究它們在侵染宿主及致病過程中的作用機理，這樣才能為以后疫苗的設計、抗菌藥物設計以及診斷方法的建立提供理論依據。目前RA毒力因子的相關研究還處于起步階段[7]，而該天然弱毒株的分離可為RA毒力基因的發現及其致病機理的研究提供很好的物質基礎。疫苗免疫被視為預防RA感染最有效的措施[8]。通過研制疫苗來控制細菌性傳染病是非常必要的[9]，國內外研制的RA疫苗很多，包括滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗等，RA血清型復雜且由于各個血清型間缺乏交叉保護性[10，11]，導致疫苗免疫效果不佳，其他僅停留在研究階段。本課題組將對該菌進行系統的免疫原性研究，以及初步從分子水平尋找鴨疫里默氏桿菌的毒力因子，以期為防制該病弱毒疫苗的研制提供可能。

參考文獻：

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[10] 汪銘書，程安春.血清3型鴨疫里默氏桿菌在我國的發現及其病原特性研究[J].中國家禽，2001，23（22）：9-12.

[11] 汪銘書，程安春，陳孝躍，等.血清5型鴨疫里氏桿菌在我國的發現及其病原特性研究[J].中國獸醫科技，2002，32（9）：16-20.

（責任編輯 程碧軍）