不同分離方法對黃鱔肝細胞活性的影響

摘要：探討了組織塊貼壁法及酶消化法（胰蛋白酶、膠原酶、胰蛋白酶-EDTA、胰蛋白酶-EDTA-膠原酶）對分離黃鱔（Monopterus albus）肝細胞的細胞數量、細胞活力和細胞增殖能力的影響。結果表明，酶消化法優于組織塊貼壁法，其中胰蛋白酶-EDTA-膠原酶分次消化法所獲得細胞數量最多，為（1.30±0.06）×107個/g，胰蛋白酶消化法所得細胞活力最高，為（90.2±1.2）%，胰蛋白酶-EDTA-膠原酶分次消化法所獲得活細胞數量最多，為（1.10±0.05）×107個/g。細胞增殖能力呈先升后降的趨勢，在48 h細胞數量最多，144 h后細胞數量明顯下降。

關鍵詞：黃鱔（Monopterus albus）；肝細胞；分離；活性；培養

中圖分類號：S917 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5543-03

肝臟是脊椎動物最大的解毒和營養代謝器官，是目前藥理學、毒理學和生理學等研究的主要對象。已有大量研究表明，體外培養的肝細胞可作為活體肝組織替代模型應用于藥理、毒理、生理等方面的研究。魚類的肝細胞培養晚于哺乳動物，目前已有報道40多種魚類的肝細胞被分離并進行體外培養，包括常見的草魚（Ctenopharyngodon idellus）[1]、鯉（Cyprinus carpio）[2]、鯽（Carassius auratus）[3]、羅非魚（Oreochromis Niloticus）[4]等，花鱸（Lateolabrax japonicus）[5]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[6]等魚類的肝細胞已建立細胞系。這些原代培養的肝細胞以及已建立的肝細胞系也被廣泛應用于藥理、毒理、生理等方面的研究[7]。黃鱔（Monopterus albus）屬合鰓魚目合鰓魚科黃鱔屬，是一種無鱗魚類，目前關于黃鱔肝細胞的培養及應用還鮮見報道。本研究比較了不同分離方法對黃鱔肝細胞的數量、活力及增殖能力的影響，為建立黃鱔肝細胞體外培養體系及作為黃鱔的藥理、毒理、生理學等相關研究的體外模型的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗黃鱔體重約為50 g，飼養于長江大學黃鱔養殖基地。

1.2 試劑

PBS（Hyclone公司），青鏈霉素、臺盼藍、胰蛋白酶、MTT（Amresco公司），小牛血清、M199培養基（Gibco公司）。

1.3 方法

1.3.1 肝細胞的分離 ①組織塊貼壁法。將黃鱔斷尾放血處死，在體積分數為70%的無水乙醇中浸泡5 min，在超凈工作臺中取出肝胰臟組織，放入培養皿中用預冷的PBS溶液進行漂洗。用眼科剪剪成1～2 mm3的小塊并除去雜質。將組織塊轉入24孔板內，每孔放2～3塊，靜置2～3 h使組織塊貼壁，吸走多余液體后每孔加2 mL培養液，置于25 ℃、5% CO2培養箱內靜置培養，每24 h倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。②胰蛋白酶消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分數為0.25%的胰蛋白酶室溫消化20 min，用血清終止其消化并收集肝細胞，用100目篩網過濾并收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，隨后加入培養液制成細胞重懸液。③膠原酶消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分數為0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化60 min，用血清終止其消化并收集肝細胞，用100目篩網過濾并收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，隨后加入培養液制成細胞重懸液。④胰蛋白酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分數為0.25%的胰蛋白酶-EDTA，室溫磁力攪拌消化30 min，用血清終止消化并收集細胞，用100目篩網過濾并收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，隨后加入培養液制成細胞重懸液。⑤胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法。按上述方法取出肝胰臟組織，按其肝臟體積的5倍左右加入體積分數為0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化30 min，然后加入體積分數為0.25%的胰蛋白酶-EDTA 4 ℃消化30 min，用血清終止消化并收集肝細胞，用100目篩網過濾并收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，隨后加入培養液制成細胞重懸液。

1.3.2 肝細胞活力的測定 將細胞重懸液與質量分數為0.4%的臺盼藍按9∶1混合，在顯微鏡下血球計數板上計數。活細胞為圓形透明，死細胞被染成藍色，用活細胞占總計數細胞中的百分比表示細胞活力。

1.3.3 肝細胞的原代培養 用含10%（V/V）小牛血清的M199培養基調整細胞密度（1×107個/mL）接種于96孔培養板，每孔接種100 μL，25 ℃、5% CO2培養箱內靜置培養。

1.3.4 肝細胞增殖率的測定 每天向12孔中加入80 μL新鮮培養基和20 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4 h后，吸去全部培養液，加入100 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕吹打至結晶完全溶解，酶標儀490 nm波長下測定吸光度，連續測定8 d。

1.3.5 數據分析 所有數據采用Statistic 6.0（StatSoft Software，USA）軟件進行統計分析，結果以平均值±標準差表示，差異顯著性用t檢驗分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同分離方法對黃鱔肝細胞數量的影響

采用組織塊培養法分離黃鱔肝細胞發現，組織塊貼壁生長，24 h后組織塊周圍有少量圓形透亮的單細胞遷出，但隨后幾天未見大量細胞遷出生長成片的現象，且組織塊邊緣模糊，遷出細胞逐漸死亡。

采用4種酶消化法對黃鱔肝細胞進行分離，結果見圖1。由圖1可知，4種方法對每克重量肝組織所獲得的肝細胞數量有所不同。其中，采用0.25%的胰蛋白酶室溫消化20 min可獲得的細胞數量為（8.20±0.50）×106個/g；采用0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化60 min可獲得的細胞數量為（9.80±0.40）×106個/g；采用0.25%的胰蛋白酶-EDTA，室溫磁力攪拌消化30 min可獲得的細胞數量為（1.00±0.04）×107個/g，與采用0.1%的膠原酶消化法所獲得的細胞數量差異不顯著（P>0.05）；而先采用0.1%的膠原蛋白酶Ⅳ室溫消化30 min，0.25%的胰蛋白酶-EDTA 4 ℃消化30 min，所獲得的細胞數量最多，為（1.30±0.06）×107個/g。

2.2 不同分離方法對黃鱔肝細胞活力的影響

采用臺盼藍法測定了4種消化法分離的活細胞數量，結果見圖2。由圖2可知，不同分離方法所獲得的有效肝細胞（即活細胞）的細胞數量之間均有顯著性差異（P<0.05），4種消化分離方法所獲得的有活力的肝細胞數量分別為（7.40±0.40）×106個/g，（9.10±0.50）×106個/g，（8.00±0.30）×106個/g，（1.10±0.05）×107個/g，其中，采用胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法可獲得的活細胞數量最多。

通過比較4種分離方法對黃鱔肝細胞的總數量和活細胞數量的影響可見，4種分離方法對肝細胞的活力影響不同（圖3），其中胰蛋白酶和膠原酶消化法對細胞的損傷最小，活力分別為（90.2±1.2）%和（89.8±2.0）%，兩者之間差異不顯著（P>0.05），與另兩種分離方法有顯著差異（P<0.05）。胰蛋白酶-EDTA消化法所分離細胞的活力最低，為（80.4±1.5）%，而3種酶混合作用所得的細胞活力為（85.9±1.7）%。

2.3 MTT法測定不同時間黃鱔肝細胞的吸光度

將膠原酶消化法分離的肝細胞按1×107個/mL每孔100 μL接種于96孔培養板中，25 ℃、5% CO2培養箱內靜置連續培養，每24 h測定其中每豎排12孔的吸光度，連續測定8 d（圖4），吸光度反映了黃鱔肝細胞的增殖能力。由圖4可知，黃鱔肝細胞增殖能力隨著時間延長呈先上升后趨于下降的趨勢。其中肝細胞接種24～48 h階段吸光度有顯著增加（P<0.05），細胞有明顯的增殖現象；72～120 h期間吸光度相對穩定，細胞未繼續增殖；144 h之后，吸光度顯著下降，細胞數量減少，細胞開始逐漸死亡。

3 小結與討論

魚類細胞分離方法主要有組織塊法、機械分離法、酶消化法和二步灌流法。研究表明不同分離方法影響細胞的分離數量和活力。組織塊消化法是最簡單的細胞分離和培養方法，常用于分離易分裂增殖的細胞，并且大多可建成細胞系。但是肝組織較其他組織而言，肝細胞是機體內較為成熟的細胞，細胞自身遷出需較長時間。對大口黑鱸（Micropterus salmoides）[8]和中華鱘（Acipenser sinensis）[9]的肝組織采用組織塊貼壁法進行細胞培養，結果細胞不能從肝組織塊中遷出；魯氏銀板魚（Metynnis roosevelti）[10]的肝細胞可以從肝組織塊中遷出，但所需時間較長，且細胞活力低，無法進行傳代培養。而花鱸[5]和半滑舌鰨[6]可以利用組織貼壁培養法分離出肝細胞。本研究中貼壁后第一天即可見黃鱔肝細胞從組織塊中遷出，但是隨后遷出細胞逐漸死亡，組織塊邊緣變模糊，可能遷出的細胞并非肝細胞或肝細胞活力較差，無法生長和增殖。

酶消化法是目前采用極為廣泛的方法，該法主要依靠各種酶的作用破壞細胞間的結締組織等之間的聯系，加上外界條件適宜，較組織塊法更容易分離獲得大量的單細胞，適用于絕大多數的組織器官。其中不含Ca2+的螯合劑（EDTA等）可以螯合掉肝組織中的Ca2+，從而可以打破固定細胞的細胞橋粒等細胞連接，但是EDTA的分散效果較差，常與酶液聯合使用。酶消化法常用的酶有胰蛋白酶和膠原酶，胰蛋白酶作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細胞間的黏蛋白及糖蛋白等，從而可以使細胞分離。膠原酶能特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其他蛋白質和組織，是肝細胞的常用酶。本研究中分別采用單酶法和混合酶法進行黃鱔肝細胞的分離，并對其細胞數量和細胞活力進行了檢測。結果表明，胰蛋白酶-膠原酶-EDTA消化法可獲得的活細胞數量最多，更適宜用于黃鱔肝細胞的分離培養。

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（責任編輯 屠 晶）