轉EGFP—attB基因PK15細胞核型分析方法的建立

摘要：以轉EGFP-attB基因PK15細胞（豬腎細胞15）為試驗材料，研究不同秋水仙素濃度、低滲時間對染色體標本制備的影響。結果表明，使用秋水仙素濃度為0.04～0.08 μg/mL、低滲時間為15～20 min時所制備的染色體標本分裂相分散好，可以做核型分析用，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測研究轉EGFP-attB基因在染色體上的整合位點奠定了基礎。

關鍵詞：豬腎細胞15；轉基因；EGFP-attB基因；核型分析

中圖分類號：Q813 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5603-03

隨著國家轉基因生物新品種培育重大專項積極穩妥地推動實施，以及國家對轉基因及生物育種的研究、安全性評價和管理的重視，人們對保護知識產權的意識逐漸加強[1-7]。目前，美、歐、日已經開始授權動物專利，而中國專利局暫不接受涉及動植物的產品權利。轉基因動植物品種的育種人僅僅可對被轉基因及其應用申請專利而間接保護轉基因動植物或動植物品種，或對其非生物學的轉基因方法及其應用申請專利保護，并以轉基因方法專利延及保護該轉基因方法直接獲得的轉基因動植物，所以，針對轉基因育種素材中外源基因的檢測越來越受到重視。轉基因豬的插入序列一般整合于宿主細胞染色體上，常以染色體原位雜交的方法來確定插入序列整合在某一條染色體的具體位點。本研究利用轉EGFP-attB基因PK15細胞制備染色體，為染色體原位雜交檢測外源基因在染色體上的整合位點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 DMEM培養液（Gibco公司），FBS（HyClone公司），PI（Sigma公司），無內毒素質粒提取試劑盒（Qiagen公司），Opti-MEM（Invitrogen公司），秋水仙素（Duchefa公司），Anti-digoxigenin-fluorescein、Nick-translation-Labeling-DNA-dUTP（Roche公司），正置顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）、載玻片及蓋玻片（FanYi公司），LSM 510 META共聚焦顯微鏡（Zeiss公司）。

1.1.2 質粒 PhiC31整合酶表達載體pCMV-Int和報告載體pBCPB+由斯坦福大學Michelle M. Calos教授饋贈；表達載體pEGFP-N1、大腸桿菌DH5α、PK15細胞（豬腎細胞15）由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所生物技術研究室保藏。引物序列為：attB-F，5′-GTCATTAATCGCCATTCAGGCTGCGCA-3′；attB-R，5′-GTCATTAATCTCGGCCTCGACTCTAG

-3′。

1.2 方法

1.2.1 載體構建 以attB-F和attB-R為引物，PCR擴增attB基因序列，PCR擴增體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、dNTPs 2.0 μL、Taq DNA聚合酶1.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模版 0.5 μL，補ddH2O至25 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。利用Ase Ⅰ酶切attB基因序列和pEGFP-N1載體，連接后轉化大腸桿菌DH5α，經PCR及酶切鑒定陽性克隆，構建為定點整合載體pEGFP-N1-attB。

1.2.2 細胞轉染與篩選 500 ng pCMV-Int、10 ng pEGFP-N1-attB、1.2 μL Lipofectamine 2000、適量的Opti-MEM混合后室溫下孵育20 min形成轉染復合物，然后逐滴加到培養基中，8 h后更換新鮮培養基，24 h后加入600 μg/mL G418開始篩選。14 d后挑取單克隆，轉移到6孔板擴繁、凍存。

1.2.3 探針標記 采用Roche試劑盒DIG-nick translation mix標記探針。取1 μg pEGFP-N1-attB質粒溶解于16 μL ddH2O中，加入4 μL DIG-nick translation mix，瞬時離心混勻后于15 ℃作用90 min，加入1 μL 0.5 mmol/L EDTA（pH 8.0）終止反應，然后加熱至65 ℃使酶失活，-20 ℃保存備用。

1.2.4 染色體制備 在培養終止前加入不同濃度的秋水仙素，處理2 h，胰酶處理細胞，收獲細胞，1 000 r/min離心5 min，用2～5 mL的0.56% KCl溶液低滲細胞，低滲時間為15～60 min，然后加0.8～2.0 mL的固定液（甲醇∶冰醋酸，體積比為3∶1）輕輕混勻；1 000 r/min離心5 min，用1 mL新的固定液重新懸浮細胞，制片前根據懸浮細胞數調整懸液的體積，直接滴加細胞懸液至1～2片玻片上，每片2個雜交區（每個區域15～25 μL細胞懸液），晾干。

1.2.5 染色及雜交 在Gimsa染液中染色10 min，流水中洗去多余的Gimsa染液，晾干，在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相并照相。37 ℃雜交16 h后，依次分別用50%甲酰胺、2×SSC、0.1×SSC洗滌，45 ℃洗2次，每次5 min，信號經羅氏Anti-digoxigenin-fluorescein試劑盒放大。DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并記錄。

2 結果與分析

2.1 載體構建與轉PK15細胞驗證

構建成功的EGFP-attB基因表達載體（圖1）經轉PK15細胞驗證，發現有綠色熒光蛋白的表達，說明載體構建成功。轉EGFP-attB基因PK15細胞經過14 d的G418篩選，發現全部表達綠色熒光蛋白（圖2），表明得到的是穩轉細胞系，EGFP-attB基因已經整合到PK15細胞的染色體上。

2.2 染色體標本制備與染色

用穩轉的PK15細胞為材料作染色體標本，用Gimsa染色后在普通正置顯微鏡下觀察，找到分散好的分裂相（圖3）。從圖3可以看出，使用終濃度為0.04～0.08 μg/mL秋水仙素、低滲時間為15～20 min時所制備的染色體標本分裂相分散好，可以做核型分析用。

2.3 共聚焦顯微鏡下的檢測

將所制標本經DAPI染色后在Zeiss LSM 510 META共聚焦顯微鏡下觀察，并采集數據。使用軟件LSM Image Examiner分析，染色體標本分裂相分散好（圖4），可以做核型分析用。

3 小結與討論

應用FISH（Fluorescence in situ hybridization）技術檢測外源基因的成功率受探針（種類、大小、標記效率）、標本（種類、處理方法）以及雜交、清洗條件、熒光抗體檢測、熒光顯微鏡靈敏度等因素影響。其中探針大小（分子雜交探針的有效長度）對FISH檢出率具有限定作用，目前普遍認為1 kb以下的探針難以成功用于FISH[8]。中期FISH檢出率較高，因為中期分裂相可通過染色體定位信號，不易受非特異信號干擾，且染色體分散，信號不易被覆蓋。而間期FISH則因特異信號與非特異信號呈現同一細胞核中，不易辨認非特異信號，出現多信號（超過預期信號數）核，且可能由于信號有時不在同一平面上，出現少于預期信號數的核，檢出率較中期FISH低。在FISH應用中，應盡可能獲取高檢出率，但還要考慮信號特異性。FISH特異性取決于雜交特異性和免疫熒光檢測中抗原抗體反應特異性，受相關實驗條件影響。因此，為獲得穩定可靠的結果，需根據探針和標本情況改變實驗條件，并觀察一定數量中期分裂相或間期細胞核，統計其檢出率，保證信號特異性。中期分裂相不易受非特異信號干擾，統計25個分裂相即可[9]。

本研究制備的染色體標本分裂相分散好，染色體分散，信號不易被覆蓋，可以用于核型分析，為下一步做染色體熒光原位雜交檢測研究轉EGFP-attB基因在染色體上的整合位點奠定了基礎。

參考文獻：

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（責任編輯 屠 晶）