甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的克隆和序列結(jié)構(gòu)分析

摘要：同源克隆結(jié)合RACE（Ropid amplification of cDNA ends）技術(shù)，從甜蕎（Fagopyrum esculentum）花芽中克隆到了半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為JN605352）。結(jié)果表明，其cDNA全長(zhǎng)1 298 bp，包括1個(gè)編碼362個(gè)氨基酸共1 089 bp的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）。其蛋白與擬南芥中木瓜蛋白酶GCP1的同源性最高，屬半胱氨酸蛋白酶家族中的木瓜蛋白酶亞家族，有1個(gè)由22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽、1個(gè)由100個(gè)氨基酸殘基組成的前體肽和1個(gè)由Cys149-His285-Asn305木瓜蛋白酶家族保守的催化三聯(lián)體活性位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：甜蕎（Fagopyrum esculentum）；半胱氨酸蛋白酶；FaRDL基因；克隆

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5609-03

半胱氨酸蛋白酶是一類重要的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各種生理生化過(guò)程[1]。許多研究表明，木瓜蛋白酶（Papain）是半胱氨酸蛋白酶中一個(gè)大的亞家族，主要參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)、疾病防御、抵制衰老以及細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程[2，3]。甜蕎（Fagopyrum esculentum）是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物，有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景廣闊。我國(guó)甜蕎種質(zhì)資源豐富，主要在我國(guó)西北部干旱瘠薄地種植，但其資源的開(kāi)發(fā)和利用與其他甜蕎主要生產(chǎn)國(guó)仍有較大的差距[4，5]。本研究探討了甜蕎木瓜蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)深入研究這一旱區(qū)雜糧作物的生產(chǎn)應(yīng)用有著重要的理論意義和生產(chǎn)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

2011年4月選取溫室干旱處理的甜蕎品種北早生的新鮮花芽作為受試材料。

1.2 總RNA的提取和cDNA的合成

用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取甜蕎花芽總RNA，并用M-MLuV逆轉(zhuǎn)錄酶[寶生物工程（大連）有限公司]合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系和操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的克隆

1.3.1 核心片斷的克隆 根據(jù)GenBank中植物的木瓜蛋白酶基因序列，設(shè)計(jì)上、下游引物FaF（5′-TGTGGTAGTTGCTGGGCATTTC-3′）和FaR（5′-CCACGAGTTCTTCACAATCCAG-3′），PCR擴(kuò)增克隆克隆FaRDL基因核心片斷。

1.3.2 3′-RACE PCR擴(kuò)增 根據(jù)獲取的基因核心片斷設(shè)計(jì)3′-RACE引物（5′-ACCGGCAACATGACC TCACTATC-3′），使用3′-full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行FaRDL基因3′端的克隆。

1.3.3 5′-RACE PCR擴(kuò)增 根據(jù)獲得的3′-RACE序列，設(shè)計(jì)5′-RACE引物FaGSP1（5′-AT CCAGTAGTCCACGCCGTTGTC-3′）和FaGSP2（5′-TCAAATCCGTCAATGCTCACAAC-3′），使用5′-full RACE Kit試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]進(jìn)行FaRDL基因的5′端克隆。

1.3.4 驗(yàn)證拼接序列的真實(shí)性和基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 根據(jù)獲取的3′-RACE和5′-RACE序列在非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)上、下游引物FaFL（5′-GCCATTGAAAG

AAGCGAGGAAG-3′）和FaRL（5′-TTAAGCACTTCTAGCTTCACCCTC-3′）驗(yàn)證拼接序列的真實(shí)性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳后回收目標(biāo)片段，將其連接至pMD18-T載體[寶生物工程（大連）有限公司]，克隆FaRDL基因。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，DNA測(cè)序由華大基因完成。

1.4 甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因的序列和結(jié)構(gòu)分析

將甜蕎FaRDL基因開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。用MEGA5.0軟件Clusta1W程序?qū)aRDL基因推導(dǎo)的氨基酸序列FaRDL（AFO83613）與NCBI中的同源蛋白序列GhCP（陸地棉Gossypium hirsutum，AER60490）、AdCP2（獼猴桃 Actinidia deliciosa，ABQ10200）、PvCP（菜豆Phaseolus vulgaris，CAB17074）、VsCP（野碗豆Vicia sativa，CAA53377）、GCP1（擬南芥Arabidopsis thaliana，Q94B08）、RD21a（擬南芥，AEE32135）和CEP1（擬南芥，Q9FGR9）進(jìn)行多重比較，選擇鄰算法NJ（Neighbour joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[6]。并用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，執(zhí)行BLAST程序分析其前體肽、催化三聯(lián)體及活性位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列的克隆

同源克隆結(jié)合3′-RACE和5′-RACE技術(shù)，從甜蕎中分離得到了包括起始密碼子和ployA尾的完整甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列。結(jié)果表明，甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL基因cDNA序列為1 298 bp，包括57 bp的5′非翻譯區(qū)（5′-Untranslated region， 5′-UTR），152 bp的3′-UTR和1 089 bp的ORF，編碼362個(gè)氨基酸和1個(gè)終止密碼子。經(jīng)BLAST比對(duì)及序列分析，其與擬南芥半胱氨酸蛋白酶家族中木瓜蛋白酶中RDL同源性最高，命名為FaRDL（GenBank登錄號(hào)為JN605352）。

2.2 甜蕎半胱氨酸蛋白酶FaRDL的結(jié)構(gòu)分析

用SignalP 4.1 Server對(duì)其信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)aRDL蛋白1～22個(gè)氨基酸殘基為其信號(hào)肽，信號(hào)肽的裂解位點(diǎn)在第22位的丙氨酸和第23位的丙氨酸之間。FaRDL蛋白22～120個(gè)氨基酸為前導(dǎo)肽，其自我剪切催化位點(diǎn)在第120位的纈氨酸和第121位的組氨酸之間，其Cys149-His285-Asn305為木瓜蛋白酶家族保守的氨基酸殘基組成的催化三聯(lián)體（圖1）。通過(guò)對(duì)FaRDL蛋白進(jìn)行的BLAST同源性比對(duì)和分子系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明，其與其他植物的半胱氨酸蛋白酶相似性高達(dá)62%～70%（圖2）。

3 小結(jié)與討論

木瓜蛋白酶（Papain-like cysteine proteases，PLCPs）屬于半胱氨酸蛋白酶C1亞類中的C1A家族蛋白酶，這個(gè)家族成員存在1個(gè)與分泌作用相關(guān)的信號(hào)肽和二硫鍵[7]。該家族成員都是以酶前體的形式合成，包括1個(gè)富含α螺旋的結(jié)構(gòu)域（alpha-helix-rich domain）和1個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)域（β-barrel-like domain），這2個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成亞單位形成1個(gè)深的裂隙，裂隙里面包含1個(gè)由Cys-His-Asn組成的酶的三聯(lián)體催化活性位點(diǎn)[2]。木瓜類半胱氨酸蛋白酶是一種非常穩(wěn)定的水解酶類，其分子質(zhì)量為23～30 ku，主要存在于液泡、質(zhì)外體和溶酶體中。其酶前體包含許多定位信號(hào)，如N-端的信號(hào)肽能保證前導(dǎo)肽正常進(jìn)入內(nèi)膜系統(tǒng)，而前導(dǎo)肽中通常具有保守的自主抑制基元ERFNIN motif，從而抑制酶前體的活性；另外，酶的前導(dǎo)肽中還具有液泡定位信號(hào)NPIR或其C末端具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL尾[3]；同時(shí)，少數(shù)酶的C末端還具有1個(gè)顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域[2]。當(dāng)酶前體被轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的細(xì)胞器后，通過(guò)分子內(nèi)或分子間蛋白水解而激活形成具有水解功能的成熟酶。

甜蕎的木瓜類半胱氨酸蛋白酶FaRDL與擬南芥的木瓜類半胱氨酸蛋白酶GCP1和RD21a聚為一類，同源性最高，分別達(dá)62%和59%，但其C末端不具有RD21a類木瓜蛋白酶所特有的顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域（Granulin-like domain），因此其與GCP1蛋白酶的同源性更高。有關(guān)甜蕎中木瓜類半胱氨酸蛋白酶FaRDL的酶學(xué)活性和生理學(xué)功能，還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯 屠 晶）