肉質相關基因TCAP啟動子與轉錄因子MyoD結合的ChIP分析

摘要：為了檢測肉質相關基因TCAP（Titin-cap，Telethonin）啟動子與轉錄因子MyoD（Myogenic differentiation antigen）的體內結合情況，采用染色質免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation，ChIP）結合PCR技術分析TCAP啟動子與轉錄因子MyoD的結合。結果表明，以MyoD抗體免疫沉淀的DNA片段為模板，PCR擴增獲得了TCAP基因啟動區121 bp的片段，實現了轉錄因子MyoD與TCAP啟動子DNA序列結合。試驗證實TCAP基因是MyoD調控的下游基因，在肌肉發育過程中發揮重要作用。

關鍵詞：染色質免疫共沉淀；TCAP基因；MyoD轉錄因子

中圖分類號：Q71 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5612-03

動物的產肉潛力及肌肉品質與肌纖維的數量和生長密切相關。TCAP（Titin-cap，Telethonin）蛋白作為一種肌絲蛋白在肌原纖維的組裝過程中發揮著重要作用，其在橫紋肌和心肌中特異性表達，是肌聯蛋白激酶的作用底物，并綁定于肌聯蛋白Z1-Z2區，通過連接和支撐肌聯蛋白為其他肌纖維蛋白提供空間上固定的結合位點[1]。TCAP基因與肌肉萎縮[2]、心肌癥[3，4]、肌營養不良[5]等均相關。在培養的骨骼肌細胞中，通過RNA干擾發現TCAP基因下調表達后會抑制成肌細胞的分化[6]，這些都證實了TCAP基因與骨骼肌發育關系密切。

TCAP基因由2個外顯子組成，在人、鼠和豬中編碼167個氨基酸，在牛中編碼166個氨基酸[7]，且在不同物種間高度保守[8]。研究表明牛TCAP基因內含子1和外顯子2的SNP位點與肉質性狀顯著相關[9]。黃京書[10]克隆了豬TCAP基因并發現了4個SNP位點，且G334A位點基因型與豬屠宰率、瘦肉率、6～7腰椎間背膘厚、胸腰椎間背膘厚、臀部平均背膘厚、三點平均背膘厚、眼肌高、眼肌寬、至第一頸椎胴體長、至第一胸肋胴體長極顯著相關，且肥肉率、肩部背膘厚、瘦肥比率性狀在不同基因型間的差異也達到顯著水平。

TCAP基因對豬肉質性狀有著密切影響，但是其作用的具體機制還不明確。課題組在前期工作中克隆了豬TCAP基因啟動子1 662 bp序列，構建了7個啟動子缺失片段重組質粒分別轉染C2C12細胞。結果表明，各個片段的啟動子活性都顯著提高，其中-155 bp/+33區段啟動子活性最高，推測為潛在的核心啟動子區。利用生物信息學技術對豬TCAP基因啟動子區序列做進一步分析后發現存在調控肌肉生長發育的肌分化因子（Myogenic differentiation antigen，MyoD）轉錄因子結合位點，且將構建的轉錄因子MyoD超表達載體與TCAP基因啟動子序列進行共轉染，發現啟動子活性明顯升高，說明MyoD對TCAP基因的表達具有一定的調控作用。故試驗采用染色質免疫共沉淀技術（ChIP）體內驗證TCAP基因啟動子序列與轉錄因子MyoD的結合情況，進一步探討TCAP基因影響肉質性狀的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

C2C12細胞系來源于華中農業大學，用含10%胎牛血清的DMEM培養基對C2C12細胞進行培養。

1.2 試劑

染色質免疫沉淀試劑盒EZ-ChIPTM Chromatin Immunoprecipitation Kit，購自美國Millipore公司；MyoD兔抗鼠的單克隆抗體，購自英國Biorbyt公司；VC750型超聲波破碎儀，購自美國Sonics公司；BIO-RAD Mylyder PCR儀，購自美國BIO-RAD公司；Taq酶、dNTPs等PCR試劑，購自北京全式金生物技術有限公司；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞交聯固定 細胞培養于培養皿中，待細胞匯合度達80%～90%，添加含有1%甲醛的20 mL細胞培養基，室溫孵育10 min后加甘氨酸終止交聯。置于冰上，用含蛋白酶抑制劑的預冷的PBS沖洗細胞，然后刮取細胞收集到離心管中，于4 ℃、800 r/min離心3 min，加入含蛋白酶抑制劑的SDS裂解液重懸細胞，再按照每管400 μL分裝溶解物（約含4×106個細胞），保存備用。

1.3.2 超聲波破碎細胞及條件優化 調整超聲波破碎儀功率大小、破碎時間、停頓時間、重復次數等條件，在冰上破碎細胞，使染色質DNA成為200～1 000 bp的片段，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄不容物，將DNA純化后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察剪切效果。

1.3.3 染色質免疫沉淀 每100 μL溶解物中含1×106個細胞，加入900 μL含蛋白酶抑制劑的ChIP稀釋緩沖液、60 μL蛋白G-瓊脂糖，4 ℃旋轉孵育60 min，5 000 r/min離心1 min獲得瓊脂糖顆粒（去除非特異結合的分子），將上清轉移至新的離心管中，并取出10 μL（1%）作為“Input”對照。在剩余上清液中，加入相應的抗體到上清液中，陽性對照中加入1 μg RNA PolymeraseⅡ抗體；陰性對照加入1 μg鼠IgG抗體；檢測樣本中加入2 μg MyoD抗體，4 ℃旋轉孵育過夜。然后加入60 μL蛋白G-瓊脂糖，4 ℃旋轉孵育60 min（以收集抗體/轉錄因子復合體），5 000 r/min離心1min，小心移除上清液（內含未結合及非特異DNA）。最后依次用低鹽洗滌緩沖液、高鹽洗滌緩沖液、LiCL洗滌緩沖液、TE緩沖液洗滌蛋白G/抗體/轉錄因子/DNA復合物。

1.3.4 解交聯及DNA純化 向復合物中加入200 μL洗脫緩沖液，輕彈管壁混勻，室溫放置15 min，5 000 r/min離心1 min，收集上清液，加入5 mol/L NaCl，并于65 ℃水浴5 h，以解交聯獲得游離DNA。加入RNase A 37 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mol/L EDTA、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.5）、蛋白酶K于45 ℃孵育60 min。采用試劑盒配套離心柱純化獲得DNA。

1.3.5 PCR鑒定 根據豬和小鼠TCAP基因序列，選擇包含預測轉錄因子結合位點及序列保守區域設計引物。上游引物5′-GTGAGTCTTGGCTCTGCT

TA-3′，下游引物5′-TCTGCTATGTCCTGCTCCT-3′，采用20 μL反應體系。反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物（121 bp）以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

2 結果與分析

2.1 超聲波條件優化

為了獲得最佳超聲波破碎條件，獲得200～1 000 bp的有效DNA片段（500 bp左右最佳），試驗采用了8個不同條件來處理樣本（4×106個細胞），比較染色質剪切效果（圖1），發現采用30%功率，破碎15 s，停頓50 s，重復15次可獲得500 bp左右片段，且降解較少。破碎時間太短，染色質無法間斷；而功率過高、破碎時間太長會造成較多DNA片段降解。

2.2 染色質免疫共沉淀檢測結果

分析豬和小鼠TCAP基因啟動子區序列，選擇保守區域且包含預測的MyoD轉錄因子結合位點的序列設計PCR引物，以免疫沉淀的DNA片段為模板，目的片段為121 bp。陽性對照以RNA PolymeraseⅡ抗體免疫沉淀的DNA為模板，陰性對照以鼠IgG抗體免疫沉淀的DNA為模板，Input對照以沒有進行免疫沉淀反應的DNA為模板，空白對照無DNA模板。結果（圖2）表明，陽性對照和Input對照均有目的擴增條帶，而陰性對照和空白對照未檢測到目的擴增條件，說明試驗結果正確可信。采用MyoD抗體免疫沉淀的DNA為模板，進行PCR擴增，獲得目的擴增條帶，且對擴增產物測序鑒定序列正確無誤，證實在C2C12細胞中MyoD轉錄因子可與TCAP基因啟動區DNA序列結合。

3 小結與討論

研究報道表明TCAP基因在骨骼肌發育中發揮重要作用，且與豬和牛等動物的肉質性狀顯著相關，但是其作用機制還不清楚。在課題組前期研究工作中，發現TCAP基因啟動子區存在MyoD轉錄因子結合位點，且將構建的轉錄因子MyoD超表達載體與TCAP基因啟動子序列進行共轉染C2C12細胞，發現啟動子活性明顯升高。而試驗采用染色質免疫共沉淀技術（ChIP），在C2C12細胞中證實TCAP基因啟動子序列與轉錄因子MyoD的結合，說明MyoD參與TCAP基因的表達調控。

MyoD是成肌調節因子（MRF）家族成員之一，不僅可促使靜止期的肌衛星細胞向成肌細胞轉化，而且能把成纖維細胞、脂肪細胞等轉化為成肌細胞，并可促進成肌細胞進一步融和、分化為成熟的肌纖維。在形成肌肉特異基因轉錄調控中起著總開關的作用[11]。MyoD缺失可導致成肌細胞的增殖和分化無法進行[12]，如應用基因敲除試驗表明缺乏MyoD和Myf5的小鼠沒有肌肉形成，沒有肌肉標志出現，也沒有myogenin促進的轉錄過程。僅有Myf5而沒有MyoD基因的小鼠，僅表達半量的Myf5和myogenin RNA。敲除myogenin基因，在胚胎鼠正常數目的肌細胞發生部位可產生幾乎正常數目的成肌細胞，但不能向肌細胞分化。田璐等[13]研究了3個黃牛品種及4個雜交肉牛群體MyoD基因的多態性，并發現其顯著影響肉牛多個肉質性狀，如宰前活重、胴體重、凈肉重、高檔肉重、眼肌面積等。邱海芳等[14]采用PCR-RFLP方法對通城豬、大白豬和長白豬3個純種及長大通豬和大長通豬2個三元雜種共5個群體MyoD基因第1內含子的多態性進行了研究，發現該基因變異會顯著影響豬肉的肉色評分是失水率；還發現豬MyoD區域與人和小鼠是保守的，而且這個區域存在影響生長和肉質性狀的QTL，揭示MyoD基因在肌肉發育過程中發揮了重要作用。

綜上所述，本研究發現轉錄因子MyoD與TCAP基因啟動子區DNA序列結合，TCAP基因可能是MyoD調控的一個下游基因，肌分化因子決定因子MyoD激活后，能進一步激活TCAP基因的表達，為肌纖維蛋白提供空間上的結合位點，有利于肌原纖維的組裝，促進成熟的肌纖維形成。這也從側面證實了TCAP基因在肌肉發育過程中發揮重要作用，然而其是否受其他肌肉發育相關轉錄因子調控，及具體作用機制還有待進一步研究。

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（責任編輯 屠 晶）