透明質酸的微生物發酵法生產與應用概況

摘要：透明質酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖組成的高分子黏多糖，廣泛地存在于動物組織中，具有獨特的生理特性，在許多領域得到廣泛的應用。目前，透明質酸的生產方法主要有提取法、微生物發酵法和人工合成法。對微生物發酵法進行了概述，對透明質酸在化妝品、保健品和醫學醫療領域的應用進行了簡要介紹，并對透明質酸的生產和應用前景進行了展望。

關鍵詞：透明質酸；微生物發酵法；育種

中圖分類號：Q538；TQ920 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-2980-04

透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是1934年Meyer等從牛眼玻璃體中提取分離得到的一種大分子多糖，故又名玻璃酸[1]。透明質酸是由2 000～25 000個通過β-1，3糖苷鍵和β-1，4糖苷鍵交替地結合在一起的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺的二糖組成的均勻重復的線性葡糖胺聚糖[2]。

透明質酸是胞外基質（Extracellular matrix， ECM）的重要組成部分[1]。近來的研究表明，透明質酸不僅廣泛存在于細胞間的胞外基質中，還存在于細胞內，主要集中分布在新生細胞的胞漿和細胞核中[2]。除了在玻璃體中外，透明質酸在關節滑液和表皮細胞間隙中的含量也十分豐富，從數量上看，50%以上的透明質酸存在于皮膚的真皮和表皮中，約35%存在于肌肉和骨骼中。目前認為透明質酸主要是存在于軟結締組織中的惰性空間填料中，在組建蛋白多糖復合物的過程中起著重要的作用[2]。

1 透明質酸的性質

在電子顯微鏡下，觀察到透明質酸分子呈線性單鏈結構，并在水溶液中擴展成隨機的線圈狀結構，線圈的直徑約為500 nm。透明質酸分子中每一雙糖單位均含有一個羧基，在生理條件下均可解離，形成陰離子，等空間距離陰離子之間的相互排斥使其分子在水溶液中處于松散的擴展狀態，占據了大量空間，故可結合多于本身1 000倍的水[3]。

根據透明質酸的來源和提取方法的不同，其相對分子質量（Mr）為8×105～5×106[4]。透明質酸的結構及生物活性具有相對分子質量依賴性，其中低相對分子質量透明質酸在低濃度時僅生成碎片狀網狀結構，而高相對分子質量透明質酸卻能生成整體的網狀結構[3]。

由于分子內存在氫鍵，透明質酸分子在水溶液中呈現單螺旋結構[5]。當透明質酸在溶液中達到一定的濃度時，透明質酸分子間便會產生相互作用，從而形成雙螺旋結構，濃度更高時則會形成網狀結構[3]。目前公認的透明質酸結構理論是三級結構理論，即透明質酸分子中每個三糖單位具有一個疏水區域，當溶液濃度較高時，透明質酸分子間的疏水區域相互作用，形成雙螺旋結構，這是透明質酸分子間相互聚集的基礎[6]。

透明質酸的特性是黏度非常高[2]，在低濃度或低相對分子質量時，溶液的黏度隨濃度或Mr的增加變化較小；當Mr和濃度增高使黏度達10 mPa·s以后，透明質酸分子便開始纏繞，此時黏度隨Mr和濃度的提高而迅速提高[3]。

2 透明質酸的生產技術

已經報道的透明質酸的生產技術有3種，即提取法、微生物發酵法和人工合成法[1]。

提取法是指從人或動物的組織中提取透明質酸[1]。提取法是最早采用的透明質酸的生產方法，目前用于生產的原料主要為雞冠、人臍帶和動物眼球，主要的工藝過程包括提取、除雜、酶解、沉淀和分離，不同組織透明質酸的提取純化過程有一定的差別[3]。但是由于提取法的原料來源局限性大，產品提取率極低（僅為1%左右），并且工藝程序復雜，因此生產成本很難降低。此外，由于在動物組織中，透明質酸與其他高分子物質相結合，導致其分離純化的難度更大，并且利用動物組織提取的透明質酸產品可能會導致感染，這些因素限制了提取法在醫藥和化妝品等工業中的廣泛應用[2，3]。

人工合成法是指先利用生物高分子合成“玻璃酸氧氮雜環戊烯衍生物”，然后添加水和羊或牛的精巢透明質酸酶，制備出衍生物和酶的復合體，最后除去酶，純化出透明質酸[1]。人工合成法尚處于實驗室研究階段，還未應用到工業化生產中[1]。

微生物發酵法是指利用經過篩選的菌種進行發酵培養，并從發酵液中分離純化得到透明質酸產品[1]。由于提取法存在上述缺點，而人工合成法又尚未成熟，故微生物發酵法成為目前生產透明質酸最主要的方法。下面對透明質酸生產的微生物發酵法進行較系統的概述。

2.1 產透明質酸菌的育種

最早發現的微生物產生透明質酸是在1937年，當時發現鏈球菌屬（Streptococcus）中具有β溶血性的釀膿鏈球菌（S. pyogenes）可產生透明質酸[7]。隨后于1939年又發現鏈球菌屬中的馬鏈球菌（S. equisimilis）和獸疫鏈球菌（S. zooepidemicus）也能產生透明質酸[7]。

由于野生型鏈球菌有能產生透明質酸解聚酶、表達其他胞外蛋白、透明質酸產率低等缺點[2]，故實際生產中要通過各種手段對野生型菌種進行改良，以滿足工業化生產的需要。

2.1.1 誘變育種 誘變劑主要包括物理誘變劑、化學誘變劑和生物誘變劑。目前應用于產生透明質酸菌種育種的誘變劑主要有紫外線、60Co γ射線和亞硝基胍（NTG）[7]。許多研究報道表明，通過上述各種誘變處理方法處理一些能夠產生透明質酸的原始菌種，如獸疫鏈球菌、馬鏈球菌等，能夠獲得透明質酸產量較高的、或者產生的透明質酸相對分子質量較大的、或者預先用透明質酸酶處理呈陰性反應的、或者是非溶血的、或者兼有以上幾種特點的優良菌株[7]。

2.1.2 原生質體育種 由于原生質體與一般的細胞相比去除了細胞壁，故原生質體對外界環境條件變化比一般細胞更為敏感，對誘變處理的反應也更為強烈[7]。目前已有成功的試驗，利用NTG等化學誘變劑或利用激光等物理誘變方法處理原始菌種的原生質體，從而獲得高產的菌株[7]。

2.1.3 基因工程育種 鏈球菌中編碼參與透明質酸合成途徑的酶的基因位于一個單順反子上，名為has操縱子。在釀膿鏈球菌中，has操縱子由3種基因組成，分別為hasA（1 248 bp）編碼透明質酸合酶（42.0 u），hasB（1 204 bp）編碼UDP葡萄糖脫氫酶（47.0 u），hasC（915 bp）編碼UDP葡萄糖焦磷酸化酶（33.7 u）[2]。雖然目前尚不清楚透明質酸鏈是如何穿過細胞膜進行轉運的，但在糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中，透明質酸合酶和UDP葡萄糖脫氫酶的表達足以指導透明質酸的生成和轉運[2]。故只需將hasA和hasB基因轉入宿主細胞內并使其在宿主細胞內表達，即可生產透明質酸[7]。

A組鏈球菌的黏液樣GAS菌株S43/192/4的HA合成基因于1993年被首次克隆并構建大腸桿菌質粒，在大腸桿菌中成功表達，合成HA[8]。隨后C組鏈球菌的HA合成基因于1997年被克隆并在大腸桿菌中表達[8]。

凌敏等[9]從馬鏈球菌總DNA中擴增出sqhas基因，構建表達質粒并轉化大腸桿菌DH5α，成功表達出sqHAS蛋白，并在加入底物的情況下合成了HA。張晉宇等[10]克隆了獸疫鏈球菌的hasB基因，并在大腸桿菌中表達，得到了相應的蛋白。

中國臺灣省Chien課題組將獸疫鏈球菌hasA和hasB基因通過NICE誘導表達系統引入乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），成功得到產生透明質酸的工程菌株[11]。

生舉正[12]將獸疫鏈球菌透明質酸合酶基因通過NICE（The nisin-controlled gene expression system）誘導表達系統引入乳酸乳球菌，并得以成功表達，合成了HA。

2.2 發酵條件的優化

鏈球菌是營養條件苛刻的細菌，需要在營養豐富的培養基上生長。鏈球菌通常在含有酵母或者動物提取物、蛋白胨和血清的混合物的復雜培養基上生長，這些培養基的配方總是包括葡萄糖（10～60 g/L）、氨基酸、核苷酸、大量的鹽、痕量的礦質元素和維生素[2]。

pH和溫度對獸疫鏈球菌的生長和透明質酸產量非常重要，有研究表明，pH 6.7±0.2，溫度37 ℃的條件對獸疫鏈球菌的生長和提高透明質酸的產量最為適合[13]。攪拌速率對透明質酸產量也有影響。研究表明，在攪拌速率低的條件下，乳酸產量高而透明質酸產量低[13]。高速率攪拌雖然會減弱乳酸合成的影響，提高透明質酸產量，但會破壞透明質酸多聚體，使其相對分子質量減小[13]。葡萄糖的初始濃度對透明質酸相對分子質量有很大的影響，研究表明當葡萄糖的初始濃度由20 g/L增加到40 g/L時，透明質酸相對分子質量也會由（2.1±0.1）×106增加到（3.1±0.1）×106[13]。

Liu等[14]報道在獸疫鏈球菌的分批發酵培養過程中，分別在8 h和12 h時添加了過氧化氫（1.0 mmol/g HA）和抗壞血酸（0.5 mmol/g HA），使透明質酸發生氧化還原解聚，相對分子質量下降，產量由5.0 g/L增加到6.5 g/L。

3 透明質酸的應用

由于透明質酸具有上述的諸多性質，使其在許多領域都得到了廣泛的應用。下面主要就透明質酸在化妝品、保健品和醫療醫藥領域的應用進行綜述。

3.1 透明質酸在化妝品中的應用

透明質酸主要存在于細胞間的胞外基質中，具有維持組織細胞胞外空間、加速營養成分流動以及保持組織的作用。首先，與傳統的保濕劑相比，透明質酸具有更好的保濕效果，并且還具有無油膩感、不堵塞毛孔的優點。其次，透明質酸水溶液具有較強的黏彈性和潤滑性，有助于在皮膚表面形成透氣的保濕膜，從而保持皮膚滋潤。再次，小分子的透明質酸能夠進入真皮層，促進血液微循環，有利于皮膚吸收營養，可以起到美容和保健作用。最后，透明質酸可以清除皮膚中因紫外線照射而產生的活性氧自由基，起到防曬和修復的作用[15]。

由于透明質酸具有以上諸多優點，故其被當作最理想的天然保濕因子而廣泛地應用于化妝品中，以達到保濕潤膚、抗皺防曬的作用。添加量一般為0.05%～0.50%[15]。

3.2 透明質酸在保健品中的應用

由于透明質酸具有保水、潤滑、促進傷口愈合和保護細胞等多種特性，故人體內透明質酸的減少會導致關節炎、皮膚老化、皺紋增多等諸多問題，因此，目前口服透明質酸補充內源性透明質酸被認為是美容保健、延年益壽的有效途徑之一[16]。

口服透明質酸的理論依據是：透明質酸經口服消化后能夠增加人體內合成透明質酸的前體，從而使體內透明質酸合成量提高，并定位到皮膚等組織中，發揮其作用。目前，已有多種形式的口服透明質酸產品問世，如片劑、膠囊劑和口服液等[16]。

3.3 透明質酸在醫療醫藥中的應用

透明質酸由于其具有獨特的黏彈性、生物相容性以及非免疫原性而廣泛地應用于眼科、骨科等多種醫學領域中[17]。

對于眼部疾病，首選的治療途徑是眼局部用藥。對眼藥而言，在一定范圍內藥物的生物利用度與藥液的黏度呈正相關，增加黏度可以延長藥物在眼部的停留時間，進而提高藥效。但有些增黏劑會導致眼部不適等副作用。透明質酸由于其具有非牛頓流體的特性和良好的生物相容性，克服了這一缺點，作為一種良好的眼藥增黏劑，值得開發和應用[18]。除用于滴眼液外，透明質酸還可以用來治療眼干燥癥狀。目前，透明質酸已經與其他多種高分子聚合物一同用于改善眼干燥癥狀[19]。

除了在玻璃體中存在之外，透明質酸也是構成關節軟骨和滑液的主要成分，當人體發生骨關節炎、類風濕關節炎及其他關節疾病時，透明質酸在關節內的產生和代謝情況異常，滑液中的透明質酸濃度和相對分子質量明顯降低，軟骨降解受到破壞。由此產生了黏彈性補充療法，即通過補充外源性透明質酸來治療關節疾病。由于該療法具有療效持久、毒副作用小等優點，日漸受到醫生和患者的青睞和重視[20]。

此外，透明質酸還在藥物傳遞系統中作為各種載體（如抗腫瘤靶向藥物載體、基因治療非病毒載體、多肽和蛋白質類藥物載體等），在手術中作為植入材料，在復發性口腔潰瘍的治療等方面得到廣泛應用[17]。

4 展望

由于透明質酸逐漸應用于各個領域，故透明質酸的微生物發酵法生產將逐步取代提取法，成為透明質酸工業化生產的主要方法，而在異源宿主中生產透明質酸的開始則標志著透明質酸的生產已經步入應用現代生物技術的階段。未來將會篩選出能夠分別生產不同相對分子質量的透明質酸的菌種，并通過發酵條件的不斷優化，以更好地為不同的領域提供可以利用的透明質酸產品。而透明質酸也將會在諸多領域得到越來越廣泛的應用。

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