溶藻細菌H5對漢斯冠盤藻的溶藻特性研究

摘要：為了進一步研究溶藻細菌H5的溶藻特性，采用透析、乙醇沉淀、有機溶劑萃取、酸堿穩(wěn)定性分析等方法探討了H5溶藻活性物質的特性。結果表明，H5的溶藻活性物質的相對分子質量在3.5～7.0 ku之間，不能用乙醇沉淀法完全分離，具有較好的親水性，在pH 4～7的酸性范圍內溶藻能力較強。H5無菌濾液使?jié)h斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）藻細胞丙二醛含量顯著上升，SOD活力在處理0～196 h內急劇上升，隨后下降，由此推測該活性物質能使藻細胞發(fā)生膜脂過氧化，從而破壞了膜的完整性。

關鍵詞：溶藻細菌；溶藻活性物質；溶藻特性；漢斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3011-04

富營養(yǎng)化已成為眾多水體普遍存在的環(huán)境問題。隨著經濟的快速發(fā)展，日益增加的工農業(yè)污染連同大型水利建設可能使我國的許多河流的富營養(yǎng)化水平進一步升高。自20世紀90年代以來漢江中下游及其支流多次暴發(fā)早春硅藻水華[1]；三峽工程建成蓄水后不久，香溪河、大寧河等主要支流庫灣每年春季暴發(fā)硅藻、甲藻水華[2]。水華發(fā)生時水色呈現褐紅色、或深或淺的醬油色，并伴有腥味，嚴重影響了當地景觀和生態(tài)系統(tǒng)服務功能[3]。面對日益嚴重的水華問題， 在物理、化學和其他生物方法除藻效果不甚理想的情況下，研究利用溶藻細菌防治水華和赤潮成為一個新的方向，引起了國內外學者的廣泛關注。

溶藻細菌是水華或赤潮發(fā)生時伴隨的一類細菌，是一類以直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞細菌的統(tǒng)稱[4]。不少研究者認為水華和赤潮的消亡都可能與溶藻細菌的溶藻功能有關[4，5]。近年來，國內外對溶藻細菌的研究主要集中在溶藻細菌的分離、藻菌的相互作用和胞外分泌物對藻細胞的作用[5，6]，但對于胞外分泌物的性質和溶藻作用機制缺乏深入研究。大多數溶藻細菌的研究都是針對藍藻水華[5-7]，而對于控制硅藻水華的溶藻細菌的研究則鮮見報道。

三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心水污染控制實驗室前期從三峽水庫香溪河庫灣爆發(fā)硅藻水華的水體中篩選出1株溶藻細菌H5，并鑒定為紡錘形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus fusiformis），其溶藻方式是間接溶藻，即分泌溶藻物質于胞外，抑制藻類的生長。本試驗通過進一步研究溶藻細菌 H5對漢斯冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）的溶藻方式、胞外活性物質的基本化學性質和作用，以期為研制高效的生物化學除藻劑提供基礎。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

試驗所用藻種為漢斯冠盤藻，藻種經活化后，在（15±1）℃、光照度為2 500 lx、光暗周期比12 h∶12 h的培養(yǎng)條件下，采用DM液體培養(yǎng)基[8]， 置于恒溫光照生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，間或振蕩。藻種的接種及傳代過程中均嚴格按照無菌操作規(guī)則進行。采用血球計數板對漢斯冠盤藻細胞濃度進行計數。

1.2 細菌培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基，分離、純化和保種采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基[9]。

1.3 溶藻細菌H5無菌濾液的制備

取50 mL 溶藻細菌H5種子液加入到 450 mL LB培養(yǎng)基中，于25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，以20 000 g 離心30 min 收集上清液，上清液用0.22 μm細菌濾器過濾，并通過固體牛肉膏蛋白胨平板進行無菌檢驗，得到H5無菌濾液。

1.4 溶藻能力的分析

溶藻能力的分析采用Kang等[10]的方法。無菌濾液、細菌培養(yǎng)液等試驗組樣品按照1∶100的比例接入100 mL指數生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，對照組則加入相同體積的新滅菌的LB培養(yǎng)基到指數生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定各組漢斯冠盤藻濃度，然后計算殺藻率，殺藻率計算公式為：殺藻率=（1-試驗組藻濃度/對照組藻濃度）× 100%。

1.5 溶藻活性物質特性分析

1.5.1 活性物質相對分子質量大小判定 活性物質相對分子質量大小的分析采用李燕等[11]的方法，略作修改。將500 mL H5無菌濾液經65 ℃旋轉蒸發(fā)至50 mL，分別取10 mL裝入截留相對分子質量為3.5 ku和7.0 ku的透析袋中，將透析袋放入蒸餾水中，以20 ℃、100 r/min振蕩透析48 h，透析期間每隔12 h 更換1 次蒸餾水。透析完成后，收集袋內透析樣并用無菌水定容至 10 mL，將此透析樣經0.22 μm濾膜過濾后按體積比1∶100 接入100 mL 指數生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定殺藻率。

1.5.2 活性物質乙醇沉淀分析 活性物質乙醇沉淀分析采用李薔等[12]的方法，略作修改。將H5無菌濾液加入無水乙醇于4 ℃下靜置1 h，以4 000 r/min離心后分別收集上清液和沉淀。將收集的上清液經65 ℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮后，再次加入無水乙醇沉淀，將上述步驟再重復1次。將收集的上清液再經65 ℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮后，用無菌水定容至50 mL，此部分為乙醇沉淀后獲得的上清液部分；將收集的沉淀用少量無菌水溶解并定容至50 mL，此部分為乙醇沉淀獲得的沉淀部分。將上清液組、沉淀組、H5無菌濾液經0.22 μm 濾膜過濾后按體積比1∶100接入100 mL指數生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d后測定殺藻率。

1.5.3 活性物質極性分析 活性物質極性分析采用文獻[11]的方法。取3份50 mL的2倍無菌濃縮液，每份分別用100 mL石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯反復兩次進行過夜靜置萃取，分別收集水相和有機相。水相經旋轉蒸發(fā)儀65 ℃真空蒸發(fā)掉殘留的有機溶劑；有機相經65 ℃真空蒸發(fā)至干后，用少量蒸餾水溶解殘留固體。兩相分別經0.22 μm濾膜過濾后，用無菌水定容至相同體積，比較兩相的溶藻效果。

1.5.4 活性物質酸堿穩(wěn)定性分析 活性物質酸堿穩(wěn)定性分析采用文獻[12]的方法，H5無菌濾液用氫氧化鈉或鹽酸溶液分別調節(jié)pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，1 h 后調回原pH（7.2），經過0.22 μm濾膜過濾后按體積比1∶100接入100 mL 指數生長中期的漢斯冠盤藻藻液中，4 d 后測定殺藻率。

1.6 丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

按照牛丹丹等[13]的方法測定MDA含量和SOD活性。即取一定量的漢斯冠盤藻藻液，在4 ℃下8 000 r/min離心收集藻細胞，加入少量磷酸緩沖液（pH 7.8）和石英砂在冰浴中研磨，勻漿液以4 ℃、8 000 r/min離心20 min，收集上清液，立即使用或者保存在-70 ℃下備用，MDA含量的測定采用TBA法。

2 結果與分析

2.1 H5溶藻活性物質的特性

2.1.1 活性物質的相對分子質量大小 采用透析的方法分析溶藻活性物質相對分子質量的大小，結果見圖1。由圖1可知，10倍無菌濃縮液經截留相對分子質量為7.0 ku的透析袋透析后，透析樣無溶藻效果；經截留相對分子質量為3.5 ku 的透析袋透析后，透析液殺藻率與無菌濃縮濾液無顯著性差異（P>0.05）。因此，H5的溶藻活性物質的相對分子質量在3.5～7.0 ku之間。

2.1.2 活性物質的乙醇沉淀分析結果 H5的無菌濃縮液經乙醇沉淀處理后，上清液組和沉淀組均有一定的溶藻效果，上清液組的溶藻效果明顯高于沉淀組（圖2）。而不管是上清液組還是沉淀組，其溶藻效果均不及原無菌濃縮液。在水溶液中，乙醇會使許多蛋白質、核酸、多糖等多種物質沉淀下來[14]，H5溶藻細菌的溶藻活性物質不排除有上述物質的可能，但是起主要溶藻作用的物質不是上述物質。

2.1.3 活性物質的極性 H5的無菌濃縮液經石油醚、四氯化碳和乙酸乙酯萃取后，水相都有較好的溶藻效果，有機相都無明顯的溶藻效果（圖3）。在上述 3 種有機溶劑萃取后所得的水相中，又以石油醚水相溶藻效果最好，殺藻率達到85.2%；四氯化碳次之；乙酸乙酯水相溶藻效果最差，殺藻率僅為56.1%，表明乙酸乙酯能萃取到少量的溶藻活性物質，能抑制藻的生長，但抑制作用不強。據此判斷活性物質為強親水性物質。

3 種有機溶劑的極性由小到大為石油醚、四氯化碳、乙酸乙酯，乙酸乙酯為中等極性的有機溶劑， 3種有機溶劑萃取到的脂溶性成分幾乎沒有溶藻活性，也表明溶藻細菌H5的活性物質為強親水性物質。

2.1.4 活性物質的酸堿穩(wěn)定性 H5的無菌濾液在pH調至4.0～7.0，1 h 后再調回原值7.2，其代謝產物的溶藻活性不受影響，其殺藻率為86.4%～92.7%（圖4）。當無菌濾液在pH為3.0或pH≥8.0，1 h后再調回原pH，代謝產物的溶藻活性大大降低，以致喪失。

2.2 H5無菌濾液對漢斯冠盤藻MDA含量和SOD活性的影響

H5無菌濾液對漢斯冠盤藻藻細胞MDA含量和SOD活性的影響見圖5。加入H5無菌濾液8 h后，藻細胞MDA含量增加40%，隨著時間的延長，MDA含量增加愈顯著，處理72、196、264 h后，MDA含量分別增加197%、496%和580%；加入無菌濾液8 h ，藻細胞SOD活力增加40%，處理72 h后SOD活力增加80%，處理196 h后SOD活力達到最大值，隨后又急劇下降。

3 小結與討論

研究結果表明，H5的溶藻活性物質的相對分子質量在3.5～7.0 ku之間。Nobuyuki 等[15]發(fā)現1株蠟狀芽孢桿菌對銅綠微囊藻的溶藻活性物質相對分子質量在2.0 ku以下。李燕等[11]研究表明，蠟狀芽孢桿菌L8和短小芽孢桿菌L18產生的溶藻活性物質對水華魚腥藻有溶藻作用，其溶藻活性物質的相對分子質量在3.5～7.0 ku之間。溶藻細菌產生的溶藻活性物質中既有親脂性的、也有親水性的，還有的同時具有親脂和親水性[16]。本研究中溶藻細菌H5產生的溶藻活性物質具有較強的親水性。Nobuyuki等[15]發(fā)現蠟狀芽孢桿菌N-14對銅綠微囊藻的溶藻活性物質在堿性范圍內非常穩(wěn)定，而在酸性范圍內穩(wěn)定性急劇下降。李薔等[12]報道1株芽孢桿菌B1的無菌濾液溶藻的最適pH為9左右。本研究中溶藻細菌H5產生的溶藻活性物質在酸性范圍內穩(wěn)定，而在堿性范圍內穩(wěn)定性下降，表明本研究中的溶藻活性物質可能是一種新的溶藻劑。

MDA含量是生物細胞膜脂過氧化的重要指標，表明細胞膜完整性被破壞的程度[17]。本研究結果表明，在0～264 h內MDA的含量始終處于增加的狀態(tài)，說明隨著無菌濾液處理時間的延長，藻細胞膜脂過氧化不斷加深，藻細胞的完整性被破壞的程度不斷加重，從而達到溶藻目的。SOD在生物抗氧化酶類中處于核心地位，它是第一個參與清除活性氧的保護酶[18]。藻細胞SOD活性在0～196 h內不斷增強，表明藻細胞受到溶藻細菌的脅迫后，保護性反應不斷升高，到達峰值后藻細胞受損，其保護性反應又不斷下降。

綜上所述，溶藻細菌H5溶藻活性物質具有分子量小、親水性強、能夠破壞藻細胞膜的完整性、在較廣的pH范圍內活性穩(wěn)定等這些特性，都有利于其發(fā)揮溶藻作用。

參考文獻：

[1] 殷大聰，鄭凌凌，宋立榮.漢江中下游早春冠盤藻（Stephanodiscus hantzschii）水華暴發(fā)過程及其成因初探[J]. 長江流域資源與環(huán)境，2011，20（4）：451-458.

[2] 諸葛亦斯，歐陽麗，紀道斌，等.三峽水庫香溪河庫灣水華生消的數值模擬分析[J].中國農村水利水電，2009（5）：18-22.

[3] 楊 敏，畢永紅，胡建林，等.三峽水庫香溪河庫灣春季水華期間浮游植物晝夜垂直分布與遷移[J].湖泊科學，2011，23（3）：375-382.

[4] JUNG S W， KIM B H， KATANO T， et al. Pseudomonas fluorescens HYK0210-SK09 offers species-specific biological control of winter algal blooms caused by freshwater diatom Stephanodiscus hantzschii[J]. J Appl Microbiol，2008，105（1）：186-195.

[5] 葉姜瑜，鐘以蓉，俞 嵐，等.一株水華魚腥藻溶藻菌的分離鑒定及菌藻關系初探[J].安徽農業(yè)科學，2011，39（29）：18121-18124.

[6] LEE S， KATO J， TAKIGUCHI N， et al. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain A28[J]. Appl Environ Microbiol，2000，66（10）：4334-4339.

[7] SHI S Y， LIU Y D， SUN Y W， et al. Lysis of Aphanizomenon flos-aquae （Cyanobacterium） by a bacterium Bacillus cereus[J]. Biol Control，2006，39（3）：345-351.

[8] BEAKES G， CANTER H M， JAWORSKI G H M， et al. Zoospores ultrastructure of Zygorhizidium affluens Canter and Z. planktonicum Canter， two hytrids parasitizing the diatom Asterionella Formosa Hassall[J]. Can J Bot，1988，66：1054-1067.

[9] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學試驗[M]. 第三版.北京：高等教育出版社，2002.

[10] KANG Y H，KIM J D， KIM B H， et al. Isolation and characterization of a bio-agent antagonistic to diatom， Stephanodiscus hantzschii[J]. J Appl Microbiol，2005，98（5）：1030-1038.

[11] 李 燕，潘偉斌，楊麗麗.三株溶藻細菌胞外溶藻活性物質若干分離特性的研究[J].微生物學通報，2008，35（2）：171-177.

[12] 李 薔，趙 玲，尹平河.芽孢桿菌B1胞外活性物質對球形棕囊藻的溶藻特性研究[J].環(huán)境科學，2012，33（3）：838-843.

[13] 牛丹丹，鄭青松，劉兆普，等.溶藻細菌YZ對銅綠微囊藻的溶藻特性研究[J].中國環(huán)境科學，2011，31（2）：321-326.

[14] 夏其昌，曾 嶸.蛋白質化學與蛋白質組學[M].北京：科學出版社，2004.

[15] NOBUYUKI N， KAZUNORI N， NORIO S， et al. A novel cyanobacteriolytic bacterium， Bacillus cereus， isolated from a Eutrophic Lake[J]. J Biosci Bioeng，2003，95（2）：179-184.

[16] WANG X L， GONG L Y， LIANG S K. Algicidal activity of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa[J]. Harmful Algae，2005，4（2）：433-443.

[17] SHI S Y， TANG D S， LIU Y D. Effects of an algicidal bacterium Pseudomomas mendocina on the growth and antioxidant system of Aphanizomenon flos-aquae[J]. Curr Microbiol， 2009，59（2）：107-112.

[18] 史順玉.溶藻細菌對藻類的生理生態(tài)效應及作用機理研究[D].武漢：中國科學院水生生物研究所，2006.