羽衣甘藍DH1代株系遺傳穩定性分析

摘要：以羽衣甘藍（Brassica oleracea var. acephala）兩個自交系（F6代）作比較，利用ISSR標記技術檢測了羽衣甘藍3個DH1代株系的遺傳穩定性，并對5個群體進行聚類分析。結果表明，3個DH1代株系DN31、DP70、DT2和兩個自交系B62、B111利用9條ISSR引物分別擴增出55、51、50、54和51條清晰條帶，其中，多態性位點DN31有3個，DP70有2個，DT2沒有，B62有19個，B111有15個。羽衣甘藍DH1代株系內基本不存在遺傳差異，基因型是純合的，兩個自交系遺傳穩定性相對較差。表明小孢子培養技術在獲得純合體材料上比人工自交的方法高效、快捷，而且獲得的純系基因型更純、更穩定。

關鍵詞：羽衣甘藍（Brassica oleracea var. acephala）；DH系；ISSR標記；遺傳穩定性；聚類分析

中圖分類號：S635.9；S503 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3056-03

利用小孢子培養技術能快速獲得育種急需的遺傳穩定材料和培育新的種質資源，提高育種效率。小孢子培養所得植株加倍后獲得的雙單倍體構成的群體稱為DH群體，從DH群體中篩選出來的株系叫DH系，DH系在遺傳上是完全純合的，可以直接作為優良親本用于品種改良[1]。科研工作者采用小孢子培養技術已獲得一系列作物的優良品系[2-4]。ISSR分子標記具有DNA樣品用量少、操作簡單、信息量大、多態性高等優點，且由于引物更長，退火溫度更高因而具有更好的可重復性和穩定性[5]，是分析種質遺傳多樣性和親緣關系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR標記技術分析植物的遺傳變異性和遺傳關系[6-8]。

羽衣甘藍（Brassica oleracea var. acephala）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）甘藍種的一個變種，二年生草本植物，觀葉為主，由于耐寒性強，觀賞期長，已成為我國廣大地區冬季及早春時節應用最廣泛的觀賞植物之一[9]。利用游離小孢子培養技術開展羽衣甘藍育種工作，能快速獲得育種急需的遺傳穩定材料，提高育種效率。小孢子植株DH系基因型理論上是完全純合的，而通過多代自交也可以達到此目的。為了比較小孢子培養技術和人工自交分別獲得純合體材料的效率，試驗以羽衣甘藍兩個自交系作比較，利用ISSR標記技術檢測了羽衣甘藍3個基因型DH1代株系的遺傳穩定性，并對5個株系進行了聚類分析。

1 材料與方法

1.1 材料

羽衣甘藍3個基因型名古屋-紅、P3、東京-白的DH1代DN31、DP70和DT2，名古屋-紅和“K12”的自交系B62（F6代）和B111（F6代），材料來源及主要特征見表1。由羽衣甘藍小孢子培養獲得的植株稱為DH0代，經DH0代自交的自交一代稱為DH1代。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 分別從供試材料各單株上取幼嫩葉片，參照王灝等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因組DNA。

1.2.2 ISSR擴增 ISSR引物自行設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系20 μL，其中10×Buffer 2 μL，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶1 U，引物0.5 μmol/L，模板DNA 20 ng。 擴增反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃復性45 s，72 ℃延伸90 s，接著梯度降溫進行復性，5個循環后穩定在53 ℃復性，進行38個循環；最后72 ℃延伸10 min，擴增產物在4 ℃保存。擴增產物用2.0%瓊脂糖凝膠（TAE電泳緩沖液，0.5 μg/L溴化乙錠）電泳檢測。在凝膠成像系統上觀察、拍照鑒定。

1.2.3 數據分析 ISSR電泳結果采取0/1賦值記帶，有帶記為1，無帶記為0。對原始矩陣用SimQual程序求Jaccard相似系數矩陣，并獲得相似系數矩陣。利用PopGene 32軟件計算擴增產物的多態性位點數（the number of polymorphic loci，N）、多態性位點比率（the percentage of polymorphic loci，P）、Shannon多樣性指數。用NTSYS-pc 2.10e軟件進行數據分析，將由“1”和“0”生成的原始矩陣用UPGMA方法進行聚類分析，最后通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 羽衣甘藍DH1代株系ISSR標記擴增產物的多態性

從38個ISSR引物中選取9個能夠獲得清晰條帶、反應穩定的ISSR引物（表2）。DN31、DP70、DT2每個株系各選取8株進行ISSR標記分析，結果表明，這3個DH1代株系9條ISSR引物分別擴增出清晰、穩定性好的條帶55、51和50條（圖1），大小在200～1 500 bp，其中多態性位點DN31為3個，DP70為2個，DT2沒有，每條引物擴增的條帶數在3～8條；3種材料的多態性位點比率分別為5.45%、3.92%和0，平均多樣性指數（I）分別為0.033 7、0.094 0和0 （表3），其中DT2沒有多態性位點，說明它的各株系間完全沒有差異；從多態性位點比率和多樣性指數上可以看出，羽衣甘藍3個材料DH1代株系間基本無遺傳差異，說明由小孢子培養所得的植株經過自交后的DH1代各株系基因型是純合的。

同時也對兩個經過6代自交的自交系材料（B62、B111）進行了ISSR分析，結果表明，B62和B111的多態性位點比率分別為35.19%和29.41%，平均多樣性指數（I）分別為0.183 6和0.167 1（表3）。經過6代自交的材料在遺傳上還遠遠沒有達到純合，說明通過小孢子培養獲得純系相對于人工自交來說，不僅縮短了育種時間，也提高了效率，能在1～2年內就獲得遺傳穩定的純系。

2.2 DH1代株系ISSR聚類分析

對羽衣甘藍3個DH1代株系和2個自交系ISSR結果進行聚類分析，結果見圖2。從圖2可以看出，DH1代株系DN31、DP70、DT2的各株系間相似系數分別為0.97～1.00、0.98～1.00和1.00，說明這3個株系在遺傳上極其相似，表明它們在遺傳上是純合的，DN31、DP70株系內略存在一些變異，這可能是自交過程中出現的稍許變異，在正常變異范圍內。而兩個自交系B62和B111的相似系數范圍則相對大許多，分別為0.82～0.98和0.83～0.94，說明這兩個自交系內各單株還存在一定程度的遺傳差異，基因型還沒有達到純合。再一次驗證了DH1代比F6代自交系純合度高。

3 小結與討論

小孢子植株DH1代理論上其基因型是完全純合的，即DH1代株系內各單株之間在遺傳組成上完全相同，不存在差異。通過ISSR標記分析了羽衣甘藍3個DH1代株系內的遺傳多樣性，并以F6代自交系作為對比，結果發現，3個DH1代株系內的遺傳多樣性都極小，其相似系數均接近于1，其中DH1代株系DT2各單株間完全沒有差異，遺傳相似系數為1.0；在DH1代株系DN31和DP70中存在較小的差異，可能是由于ISSR分析過程中存在某些誤差，或者是種植于大田中受到環境因素的影響發生的稍許變異。總體來講，羽衣甘藍的DH1代株系內基本不存在遺傳差異，基因型是純合的。被試的兩個自交系的遺傳多樣性則相對大得多，說明自交6代的自交系其在遺傳上遠未達到純合，因此羽衣甘藍要想通過人工自交的手段獲得純系，自交6代還遠不夠，估計至少要自交8～10代。這也證實了小孢子培養技術在獲得純合體材料上比人工自交的方法更高效、快捷，而且獲得的純系在基因型上更純、更穩定。

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