產(chǎn)甘露聚糖酶解淀粉芽孢桿菌的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

摘要：從海底淤泥中篩選出一株產(chǎn)高活性β-甘露聚糖酶的菌株，經(jīng)16S rDNA序列分析表明，該序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA序列同源性為100%，將該菌株命名為Bacillus amyloliquefaciens T27。對(duì)該菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，以魔芋粉為碳源，酵母粉為氮源，裝液量為50 mL，250 r/min、37 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液中粗酶活力能達(dá)到98.0 U/mL。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；甘露聚糖；甘露聚糖酶

中圖分類號(hào)：TQ925+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3105-04

目前，在全球能源危機(jī)、糧食缺乏及環(huán)境保護(hù)越發(fā)重要的情況下，甘露聚糖酶在食品、造紙、印染、紡織等許多方面都具有重要作用[1-4]。β-甘露聚糖酶能特異性水解甘露糖類半纖維素，產(chǎn)生大量甘露寡糖和少量甘露糖[5]。該酶廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物中[6]，其中微生物來源的甘露聚糖酶具有易于大規(guī)模生產(chǎn)、來源穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，因此，尋找發(fā)掘能夠產(chǎn)甘露聚糖酶的微生物資源備受人們關(guān)注。由于工業(yè)生產(chǎn)中要求所使用的甘露聚糖酶具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性、耐熱性及耐酸堿等特性，普通土壤環(huán)境下微生物產(chǎn)生的酶很難滿足這一要求。海洋尤其深海環(huán)境特殊，包括了高壓、低溫、高鹽、極端pH等，這一特殊環(huán)境中蘊(yùn)藏著大量的稀有微生物資源。由于深海微生物產(chǎn)生的酶往往具有耐高溫、耐高壓和耐鹽堿等特點(diǎn)[7]，在一些較為苛刻的工業(yè)環(huán)境中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用價(jià)值。因此，從海洋微生物中發(fā)掘新的酶資源受到越來越多的關(guān)注。

本研究從海底淤泥中篩選到一株產(chǎn)甘露聚糖酶的海洋細(xì)菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并初步研究了該菌株的最佳產(chǎn)酶條件，為進(jìn)一步利用該海洋菌株生產(chǎn)甘露聚糖酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑 海底淤泥樣品取自廈門深海；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司；槐豆膠、低熔點(diǎn)瓊脂、蛋白胨和酵母粉購自英國Oxoid公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）選擇培養(yǎng)基。魔芋粉20.0 g，酵母膏20.0 g，NaCl 6.0 g， MgSO4·7H2O 1.0 g， KH2PO4 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.5。

2）種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）。蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的篩選與鑒定 取約2 g泥樣加入到100 mL蒸餾水中浸泡2 h左右， 取適量泥樣懸液稀釋， 不同濃度梯度分別涂布在固體選擇培養(yǎng)基上， 37 ℃倒置培養(yǎng)2 d后，用0.1%剛果紅染色10 min后棄去染液，用蒸餾水洗脫，選出透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株[8]。將篩選出的甘露聚糖酶高產(chǎn)菌株在LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)12～16 h，提取細(xì)菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（fP1：5′-AGAGTTTGAT

CCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG

ACTT-3′），PCR擴(kuò)增所篩選出菌株的16S rDNA， PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將測(cè)序（測(cè)序交由華大基因公司完成）后的序列通過與GenBank中登錄的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定篩選出的菌株的種屬。

1.2.2 甘露聚糖酶的活力測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定還原糖含量[9]。取10 μL甘露聚糖酶加入到90 μL 0.5%槐豆膠底物，55 ℃反應(yīng)30 min，然后加入100 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴10 min，冷卻后加蒸餾水定容至1 mL，再取200 μL加至96孔板中，測(cè)定OD540 nm。

1.2.3 產(chǎn)甘露聚糖酶菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 ①培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL液體選擇培養(yǎng)基，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)12、24、48 h取樣測(cè)定酶活。②培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL液體選擇培養(yǎng)基，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于28、37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為200 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活。③碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL以魔芋粉和槐豆膠為不同碳源的液體選擇培養(yǎng)基，分別接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活。④氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響。250 mL三角瓶裝入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4為不同氮源的培養(yǎng)基，分別接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活。⑤培養(yǎng)基裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響。250 mL的三角瓶中裝入25、50、75、100 mL的液體選擇培養(yǎng)基，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的篩選

利用選擇培養(yǎng)基從海底淤泥樣品中篩選高產(chǎn)甘露聚糖酶的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一株菌落形態(tài)光滑的海洋細(xì)菌，出現(xiàn)較大、較清晰的水解圈（圖1）。

2.2 產(chǎn)甘露聚糖酶菌株的鑒定

LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌過夜后，抽提細(xì)菌的基因組DNA。以基因組DNA為模板，利用16S rRNA通用引物PCR擴(kuò)增16S rDNA，結(jié)果見圖2。由圖2可知，擴(kuò)增的16S rRNA條帶清晰、特異，將回收的16S rDNA片段送至華大基因公司測(cè)序。與GenBank中登錄的基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與解淀粉芽孢桿菌的16S rRNA同源性為100%。根據(jù)基于近緣種的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，該菌株與DSM11031和B-23049（T）形成一個(gè)分支，有100的自展值（圖3）。將該菌株命名為Bacillus amyloliquefaciens T27。

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

利用以魔芋粉作為選擇培養(yǎng)基的惟一碳源，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)12、24、36、48 h后取樣測(cè)定酶活，研究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響（圖4）。由圖4可知，24 h內(nèi)甘露聚糖酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到最高點(diǎn)；24 h后甘露聚糖酶活力緩慢下降。這與菌株的生長速率以及酶的表達(dá)量、失活速率是基本一致的。

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

利用以魔芋粉作為選擇培養(yǎng)基的惟一碳源，接種2%的種子培養(yǎng)液，置于28、37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活，研究培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響（圖5）。由圖5可知，37 ℃培養(yǎng)條件下甘露糖聚酶活力比28 ℃時(shí)高出大約20%，37 ℃培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶更有利。

2.5 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

天然菌株通常為誘導(dǎo)產(chǎn)酶，不同的碳源由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，對(duì)菌株的誘導(dǎo)產(chǎn)酶也不同。250 mL三角瓶分別裝入50 mL以魔芋粉和槐豆膠為不同碳源的選擇培養(yǎng)基，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活（表1）。從表1中可以看出，菌株在以魔芋粉作為惟一碳源時(shí)，產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于槐豆膠。

2.6 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有重要影響。250 mL三角瓶分別裝入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4為不同氮源的培養(yǎng)基，分別接種2%的種子培養(yǎng)液，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活（表2）。從表2中可以看出，菌株在以酵母粉作為惟一氮源時(shí)，產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于其他氮源。

2.7 培養(yǎng)基裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基裝液量直接影響搖瓶發(fā)酵中細(xì)菌生長的氧氣量，從而影響發(fā)酵過程中菌株的生長和產(chǎn)酶能力。250 mL的三角瓶中裝入25、50、75、100 mL的液體培養(yǎng)基，置于37 ℃的搖床，轉(zhuǎn)速為250 r/min培養(yǎng)24 h后取樣測(cè)定酶活（圖6），由圖6可知，50 mL培養(yǎng)基裝液量產(chǎn)酶活性最高，達(dá)到98.0 U/mL，培養(yǎng)基中氧氣含量直接影響解淀粉芽孢桿菌T27的產(chǎn)酶量。

3 小結(jié)與討論

甘露聚糖酶在生物能源、飼料和食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用，甘露聚糖酶的發(fā)酵優(yōu)化和重組表達(dá)能夠?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)這類酶提供參考。通過透明圈法篩選得到了能夠水解甘露聚糖的海洋細(xì)菌菌株，其中解淀粉芽孢桿菌T27在甘露聚糖平板上能夠顯示出相對(duì)較大的水解圈，而且相對(duì)于其他海洋細(xì)菌的水解圈，解淀粉芽孢桿T27水解圈透明度較高。

解淀粉芽孢桿菌T27在以魔芋粉為碳源，酵母粉為氮源，蛋白胨為蛋白水解物，（NH4）2SO4為無機(jī)氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)酶效果最好。魔芋粉的主要成分為葡甘露聚糖，而葡甘露聚糖是天然的甘露聚糖以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結(jié)而成的線狀多糖，加上部分葡萄糖殘基形成的[10]。槐豆膠主要為半乳甘露聚糖，主要是以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷鍵連結(jié)而成的線狀多糖，加上部分修飾的半乳糖殘基形成[11]。這表明解淀粉芽孢桿菌T27甘露聚糖酶在葡甘露聚糖的誘導(dǎo)下表達(dá)好，可能與甘露聚糖酶的水解特性和甘露聚糖酶基因的啟動(dòng)子的特異性有關(guān)。不同的氮源，其氮元素的配比和含量上都有明顯的區(qū)別，這在甘露聚糖的表達(dá)誘導(dǎo)上能發(fā)揮主要作用。解淀粉芽孢桿菌T27培養(yǎng)24 h產(chǎn)酶活性最高，這與芽孢桿菌的生長特性以及甘露聚糖酶的表達(dá)特性有關(guān)。培養(yǎng)基的裝液量主要影響容氧量。當(dāng)裝液量過高時(shí)，容氧量過低，會(huì)影響菌體生長，從而影響產(chǎn)酶；當(dāng)裝液量過低時(shí)，搖床轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生過大的機(jī)械剪切力，使菌體難以與營養(yǎng)成分粘附，導(dǎo)致產(chǎn)酶降低。

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