綠色木霉外源基因表達系統的構建

摘要：利用PCR方法克隆瑞氏木霉（Trichoderma reesei）外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）啟動子序列，以pSK載體為骨架，構建了pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體，并成功轉入到綠色木霉（T. viride）Sn-9106中。通過對綠色木霉Sn-9106進行遺傳改造，為纖維素酶基因在木霉中同源重組表達提供遺傳轉化平臺。

關鍵詞：綠色木霉（Trichoderma viride）；cbhⅠ啟動子；綠色熒光蛋白；外源基因表達

中圖分類號：Q786；Q939.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）13-3180-03

纖維素酶在木質纖維素資源化利用過程中發揮著重要的作用。目前纖維素酶存在酶活性低、對天然木質纖維素分解能力弱、生產周期長以及價格昂貴等問題，嚴重制約了其工業化應用[1，2]。本實驗室選育的綠色木霉（Trichoderma viride）Sn-9106能以秸稈、紙漿等工業廢物為碳源，將其中的纖維素轉化為可發酵的糖成分，是一株適合固體發酵模式的纖維素酶工業生產菌株[3-5]。隨著基因工程技術的不斷發展，利用分子生物學手段研究絲狀真菌纖維素酶系分泌機制、活性及協同作用等逐漸成為目前研究熱點[6-8]。研究表明，纖維素酶在大腸桿菌表達系統中容易形成包涵體、酶活性比較低、缺乏糖基化修飾；在酵母中表達又存在著過度糖基化和蛋白折疊等問題，使表達的纖維素酶活性嚴重喪失[9]。目前木霉為適合真菌類纖維素酶的表達載體之一[10]。瑞氏木霉（Trichoderma reesei）中外切葡聚糖纖維二糖水解酶Ⅰ基因（cbhⅠ）是纖維素酶基礎性表達基因之一。在異源表達過程中，cbhⅠ啟動子在沒有誘導物存在的情況下也能夠啟動報告基因表達[1]。本研究利用瑞氏木霉cbhⅠ啟動子、以綠色熒光蛋白為報告基因、潮霉素為抗性標記構建綠色木霉表達載體，為構建高產纖維素酶基因工程菌奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 瑞氏木霉QM9414、綠色木霉Sn-9106、pET30-GFP質粒和pSK質粒載體由沈陽農業大學生物技術學院保存；pSM565質粒由沈陽農業大學生物技術中心提供；感受態細胞E. coli DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司；pMD19-T Simple Vector購自寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、Long Taq DNA聚合酶等PCR試劑，質粒小量提取試劑盒，DNA Marker，潮霉素，IPTG，X-Gal均購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內切酶，T4 DNA連接酶均購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自愛思進生物技術（杭州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 cbhⅠ啟動子、GFP基因、hph基因的克隆 根據GenBank NCBI上瑞氏木霉cbhⅠ啟動子、GFP基因及hph基因序列設計引物如表1。提取瑞氏木霉基因組DNA[11]，并以基因組DNA為模板，PCR擴增克隆出cbhⅠ啟動子。cbhⅠ啟動子用二步法進行PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s ，72 ℃ 3 min，5個循環；94 ℃ 30 s，67 ℃ 3 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。分別以pET30-GFP和 pSM565質粒為模板擴增出GFP基因、hph基因。GFP基因PCR擴增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。hph基因PCR擴增程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物回收后，與pMD 19-T Simple Vector連接，并送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.2.2 cbhⅠ啟動子表達載體pSK-cbhⅠ的構建 將pMD 19-T-cbhⅠ用SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切，然后與經同樣酶切的pSK載體連接，得到重組質粒pSK-cbhⅠ，轉化E. coli DH5α感受態細胞。在含氨芐青霉素的培養基上隨機選取白色轉化子，小量提取制備轉化子質粒用于酶切鑒定。

1.2.3 表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構建 將pMD 19-T-GFP用EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切，與同樣雙酶切的重組質粒pSK-cbhⅠ連接，得重組質粒后，再以同樣的方法將pMD 19-T-hph進行酶切和連接，構建表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph。

1.2.4 綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的轉化 綠色木霉Sn-9106原生質體的制備和轉化參照文獻[12]。將適量轉化液涂布于再生培養基， 28 ℃培養12～16 h；在再生培養基上添加一層含75 μg/mL潮霉素的半固體絲狀真菌MM培養基，28 ℃培養3～4 d；挑選潮霉素抗性轉化子，接種于PDA斜面培養基上繼續培養3～5 d；挑取斜面培養基上的綠色木霉制成水壓片，在熒光顯微鏡下觀察菌絲，選取有熒光的綠色木霉接種于MM液體培養基中，28 ℃、150 r/min培養3 d；利用PCR方法檢測GFP基因。

2 結果與分析

2.1 cbhⅠ啟動子、GFP基因和hph基因的克隆

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，利用Bio-Rad凝膠成像系統觀察PCR擴增結果（圖1-圖3）。PCR產物電泳條帶清晰完整，cbhⅠ啟動子大小約為1 500 bp，GFP基因大小為726 bp，hph基因大小為1 026 bp，均與預期大小相符。測序后進行BLAST比對分析同源性分別達到96%、90%和92%。

2.2 綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph的構建

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體轉化E. coli DH5α，在氨芐培養基上隨機選取白色轉化子，提取質粒后經酶切鑒定見圖4。酶切產物大小與cbhⅠ啟動子、GFP基因、hph基因片段大小相符。綠色木霉表達載體pSK-cbhⅠ-GFP-hph圖譜如圖5所示。

2.3 pSK-cbhⅠ-GFP-hph轉化綠色木霉Sn-9106

將pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體轉化綠色木霉Sn-9106原生質體中，在含75 μg/mL潮霉素的培養皿上得到16個抗性轉化子，利用表1中3對引物進行PCR檢測，PCR產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Bio-Rad凝膠成像系統觀察結果（圖6）。由圖6可知，cbhⅠ啟動子、hph基因及GFP基因均已轉化到綠色木霉中。將轉化子單菌落經PDA培養基擴大培養后，制成水壓片，在熒光顯微鏡下可觀察到含有綠色熒光的菌絲（圖7）。

3 小結

本研究利用pSK載體為骨架，構建了帶有cbhⅠ啟動子的pSK-cbhⅠ-GFP-hph表達載體，在熒光顯微鏡下觀察到含有綠色熒光的菌絲，證實綠色木霉外源基因表達載體構建成功。雖然驗證了綠色熒光蛋白的表達，但對于cbhⅠ啟動子是否對外源基因啟動了高效表達還有待進一步研究。絲狀真菌纖維素酶表達系統表達出的酶為混合酶系，給分離純化目的蛋白造成很大的障礙，而且絲狀真菌纖維素酶啟動子為誘導型，所以在利用絲狀真菌作為纖維素酶表達宿主時，通常構建組成型表達載體。另外也有文獻報道，以絲狀真菌啟動子構建載體表達外源蛋白，須在外源蛋白基因前加入信號肽。因此，下一步對瑞氏木霉cbhⅠ啟動子的作用機制進行研究，并應用于對綠色木霉纖維素酶基因的改造。

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