“小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗”方法的改進與研究

摘 要：連續3d給小鼠腹腔注射淀粉液，誘導并激活巨噬細胞，使用魚紅細胞為吞噬物，替代細胞實驗教材所用的雞紅細胞、羊紅細胞，探索和改進實驗方法，以便更清晰、有效地觀察小鼠腹腔巨噬細胞對外來異物的吞噬作用。取鼠腹腔液制備涂片并固定，用Giemsa染色法進行染色，顯微觀察巨噬細胞對魚紅細胞的吞噬作用。結果顯示，采用魚紅細胞作為吞噬物，細胞染色清晰，吞噬結果明顯，可清晰顯示大量吞噬魚紅細胞的巨噬細胞，吞噬百分率高，便于實驗觀察和計數，有助于學生對巨噬細胞吞噬作用的理解和掌握。

關鍵詞：巨噬細胞；魚紅細胞；實驗方法；吞噬

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）23-17-02

高等動物體內的巨噬細胞、單核細胞和中性粒細胞等多具有吞噬功能，均由骨髓干細胞分化而來，是機體非特異性免疫功能的重要組成部分。當病原微生物或其他異物侵入機體時，由于巨噬細胞具有趨化性，便向異物處聚集，巨噬細胞可將之內吞入胞質，形成吞噬泡，然后在胞內與溶酶體融合，將異物消化分解，這在機體非特異性免疫中具有重要意義。靜息的巨噬細胞吞噬功能低下，只有活化狀態下的巨噬細胞才具有較強的吞噬能力。現在所用細胞實驗教材[1-4]所編列吞噬實驗大多用雞紅細胞、羊紅細胞、墨水、桿菌[5]、熒光微球等作為吞噬物，本文首次使用魚血細胞作為吞噬物，對小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬效果進行了探索和研究，以期避免使用家禽作為實驗材料，并進一步完善了實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 魚血紅細胞稀釋液的制備 從市場上購買鯽魚，用注射器尾靜脈采血，或解剖后從魚血竇或心臟抽取魚血。抽取的魚血，不添加抗凝劑，直接用無血清L15培養基（Gibco，invitrogen Corporation），稀釋10倍。配成10%魚血紅細胞懸液備用。

1.1.2 3%可溶性淀粉溶液的制備 稱取可溶性淀粉3g，溶于100mL生理鹽水中，混勻后121℃高壓滅菌20min備用。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的誘導 在實驗前3d，連續3d定時給小鼠腹腔注射3%淀粉液。注射部位在腹部中央，持針以45°斜角刺入，注意勿傷及內臟或注入腸內，注射后揉動腹部，分散淀粉粒，并觀察注射后動物狀態，以免小鼠死亡。

1.2.2 魚紅細胞的注射及腹腔液的收集 實驗時，小鼠腹腔注射10%魚紅細胞懸液1mL，輕按小鼠腹部，使懸液分散。60min后，用頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠腹面朝上，于腹部中央用有齒尖鑷夾起皮膚層，用剪刀剪一環口，撕開腹部皮膚，充分暴露腹膜。此時，向腹腔注射1mL生理鹽水，并輕揉腹部片刻。隨后用剪刀剪開腹膜成一縱形口，用鑷子將兩邊皮膚夾起來，以防腹腔液流出。把內臟推向一側后，可用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液，小心操作，以免腹腔內血管破裂，吸取到小鼠腹腔外周血細胞。

1.2.3 制片及染色方法 取腹腔液滴于潔凈的載玻片上，按血涂片制備法制備細胞涂片。空氣干燥后，載片放入100%甲醇液的固定缸中固定5min。固定后的載片，采用扣染法，即用牙簽架起載片，細胞面朝下反扣在玻板上，用Giemsa染色液（Giemsa原液1份，0.075mol/L磷酸緩沖液9份）染色載片，染色時間為20min。染色完成后，揭起載片，用滴管吸取蒸餾水輕緩沖洗載片，洗去多余的染液。

1.2.4 顯微觀察及吞噬百分率和吞噬指數的計算 載片空氣干燥后，在OLympus BX41顯微鏡下觀察，用DP70攝像頭進行顯微拍攝，并用IPP5.0軟件進行顯微照片標尺標記。40倍物鏡下已能觀察到游離的魚紅細胞及吞噬魚紅細胞的巨噬細胞。實驗共用小鼠5只，實驗過程中未出現死亡，每只小鼠制備5片涂片。每片隨機觀察數個視野，記錄100個吞噬細胞的吞噬結果，計算吞噬百分率、吞噬指數。吞噬百分率（%）=吞噬魚紅細胞的巨噬細胞數/計數的總巨噬細胞數（吞噬及未吞噬的）×100。吞噬指數=巨噬細胞中所吞噬的魚紅細胞數/計數的總巨噬細胞數。

2 實驗結果

2.1 巨噬細胞吞噬狀態 在普通光學顯微鏡下，可清晰觀察到主要的三類細胞，魚紅細胞、未吞噬魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中1）及吞噬一個或數個魚紅細胞的巨噬細胞（圖1中2～4）。鯽魚紅細胞多為長橢圓形，核常位于細胞中部，胞核染為深紫色。巨噬細胞大多呈不規則形狀，胞體表面不光滑，常有突觸，細胞核較大，呈腎形、圓形或其他不規則形狀，染為紫紅色。巨噬細胞吞噬魚紅細胞，常能觀察到以下幾種吞噬狀態：巨噬細胞內魚紅細胞膜仍完整；巨噬細胞內魚紅細胞膜不完整或破裂；巨噬細胞內具有一個或數個大小不等的魚紅細胞細胞核；還可觀察到巨噬細胞膜凹陷，魚紅細胞緊貼在凹陷處正在被吞噬。圖1顯示激活狀態的巨噬細胞及多種吞噬魚紅細胞的狀態。

2.2 吞噬率和吞噬指數 實驗測得小鼠腹腔巨噬細胞吞噬魚紅細胞的吞噬率為25.0%，吞噬指數為0.31。與雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數相近[6-7]。

3 討論

小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗是生物科學及醫學專業本科層次細胞生物學課程開設的實驗必修項目。近年來，由于禽流感[8]的流行，細胞生物學教學實驗室通過多次試驗、反復摸索和研究“小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗”這一實驗內容，在傳統方法的基礎上不斷改進。主要的改進有以下3個方面：一是采用小鼠實驗前連續3d定時免疫，有效增加了腹腔內處于激活狀態的巨噬細胞數量。二是取魚血紅細胞作為吞噬物，且所取魚血不用添加抗凝劑，直接用不加血清的L15細胞培養液來稀釋血細胞，實驗效果明顯，完全符合實驗要求。三是染色方法的好壞直接關系到對實驗結果的觀察，本實驗應用Giemsa染色扣染法，巨噬細胞及魚紅細胞染色均清晰，細胞的形態結構更加明顯，能有效地分辨各類細胞的細胞核、細胞漿及吞噬魚紅細胞的各種狀態。此實驗方法已用于我院本科生實驗教學，師生們普遍認為實驗結果便于學生觀察和計數，有助于學生對吞噬細胞吞噬作用的理解和掌握，提高教學效果。

綜上所述，采用魚血細胞作為吞噬物，實驗結果明顯，吞噬率及吞噬指數均高于或接近于雞紅細胞的數據，并進一步完善了實驗方法，實驗結果更直觀與清晰。同時巨噬細胞吞噬實驗常用于免疫增強藥物活性的測定，其中以體內法最能反應實際吞噬能力，這一方法常用雞紅細胞來進行測定，是否也可用便于取材的魚紅細胞來測定，值得進一步實驗和探討。

參考文獻

[1]李素文.細胞生物學實驗指導[M].北京：高等教育出版社，2001.

[2]王金發，何炎明.細胞生物學實驗教程[M].北京：科學出版社，2004.

[3]桑建利，譚信.細胞生物學實驗指導[M].北京：科學出版社，2010.

[4]楊漢民.細胞生物學實驗·二版[M].北京：高等教育出版社，1997.

[5]朱兆玲，周紅，李美玉，等.吞噬細胞吞噬作用實驗方法的改進[J].臨床醫學工程，2012，19（4）：524-525.

[6]張華，曲震寰，王瑩，等.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養與吞噬功能測定[J].黑龍江醫藥科學，2007，30（5）：9.

[7]湯城，薛雅蓉，余飛，等.一種檢測巨噬細胞吞噬雞紅細胞活性新方法的建立[J].畜牧與獸醫，2005，37（11）：47-48.

[8]徐德忠，張揚，王波，等.人感染H7N9禽流感分布異常及其異常起源之可能[J].中華疾病控制雜志，2013，17（8）：645-650.

（責編：施婷婷）