兔腦血管痙攣前后基底動脈中PDEⅤ表達變化

【摘要】 目的：探討兔蛛網膜下腔出血腦血管痙攣前后基底動脈中PDEⅤ的表達變化。方法：制作腦血管痙攣動物模型，空白對照組、實驗對照組與SAH組均于制模后第3天行TCD與選擇性椎-基底動脈造影，檢測兔腦血管痙攣的發生及變化，檢測完后，取其基底動脈，制成病理切片備用。通過免疫組化檢測兔基底動脈中PDEⅤ的表達。結果：各配伍組中TCD測得的基底動脈血流速度、DSA測得的基底動脈管徑值及免疫組化陽性表達產物的SUM值不等或不全相等（P<0.05），經Student-Newman-Keuls檢驗對各配伍組數據進行兩兩比較，SAH組與空白對照組、SAH組與實驗對照組TCD測得的基底動脈血流速度、DSA測得的基底動脈管徑值及免疫組化陽性表達產物的SUM值不等（P<0.05），空白對照組與實驗對照組TCD測得的基底動脈血流速度、DSA測得的基底動脈管徑值及免疫組化陽性表達產物的SUM值差異無統計學意義（P>0.05）。結論：兔蛛網膜下腔出血腦血管痙攣后PDEⅤ在其基底動脈中明顯表達，推測PDEⅤ表達可能與腦血管痙攣發生有關。

【關鍵詞】 蛛網膜下腔出血； 腦血管痙攣； 磷酸二酯酶Ⅴ； 兔

腦血管痙攣（CVS）作為蛛網膜下腔出血最嚴重的并發癥，是蛛網膜下腔出血致死和致殘的首要原因。研究認為，蛛網膜下腔出血后氧合血紅蛋白使血管內皮細胞產生的NO減少，繼而通過NO-GC-cGMP途徑使血管平滑肌細胞中cGMP含量減少，引起腦血管痙攣[1]。鳥苷酸環化酶（GC）和磷酸二酯酶（PDEs）是細胞內調節cGMP含量的兩種相互拮抗的重要生物酶，他們的含量及活性變化直接影響細胞內cGMP含量，GC含量增多或活性增強可使細胞內cGMP含量減少，PDEs含量增大或活性增強可使細胞內cGMP含量增加，反之亦然。目前，對通過增加NO產生而使cGMP含量增多來緩解腦血管痙攣的研究較多，而對通過抑制磷酸二酯酶活性使cGMP降解減少來緩解腦血管痙攣的研究較少。筆者通過“枕大池二次注血法” 制成兔腦血管痙攣模型[2]，探討兔蛛網膜下腔出血腦血管痙攣前后基底動脈中PDEⅤ的表達變化，判斷其與腦血管痙攣的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔（山東大學動物實驗中心）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗 （1）分組及制模：新西蘭大白兔24只，雄性，體重2.5～3.0 kg，按照體重接近的條件配成8個配伍組，然后將各配伍組中3只新西蘭大白兔隨機分配到3個組，每組各8只。適應性喂養1周后，用10%水合氯醛（3 ml/kg，腹腔注射）和速眠新（0.2 ml/kg，肌肉注射）麻醉，采用枕大池二次注血法制成兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣模型，SAH組注入枕大池的為自體動脈血（0.5 ml/kg），實驗對照組注入枕大池的為生理鹽水（0.5 ml/kg），空白對照組無操作。兩次操作間隔時間為48 h，規定第1天為第2次操作后24 h，以此類推。

（2） TCD及選擇性椎-基底動脈造影：空白對照組、實驗對照組和SAH組均于制模后第3天行TCD與選擇性椎-基底動脈造影檢查[2]。TCD取俯臥位，充分暴露頸部，于枕外結節下2 cm處，用2MHzTCD探頭檢查基底動脈流速[TCD參數調節為：V 10 mm，D（27±3）cm，W 107 mW/cm2]，保留TCD測得的血流頻譜及其平均流速（Vm） （圖1、圖2）。

DSA 取仰臥位，暴露右側腹股溝，游離右側股動脈，穿刺股動脈，交換置入Prower-14微導管，微導絲導引下將微導管選至左側椎動脈內，行椎-基底動脈造影檢查，造影結束后，撤出微導管，結扎股動脈，所用物品均肝素化。雙盲法測量基底動脈上、中、下段的血管直徑，取3點平均值作為基底動脈直徑（圖3、圖4）。

（3）取材：完成上述兩項操作后，將動物處死、灌注，取其基底動脈作為標本，將標本用10%的福爾馬林浸泡1周，按常規方法制成病理切片，以備后用。

1.2.2 免疫組化 （1）切片脫蠟及水化；（ 2）微波熱修復；（3）3%H2O2水孵育、PBS液沖洗，阻斷過氧化物酶；（4）滴加一抗（1：750稀釋的山羊抗人PDEⅤ抗體）；（5）滴加二抗；（6）顯色；（7）蘇木精復染；（8）乙醇脫水；（9）二甲苯透明；（10）封片。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13軟件包對所得數據進行統計學處理，實驗數據采用（x±s）表示，運用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCD與選擇性椎-基底動脈造影的檢測結果 TCD測得空白對照組、實驗對照組、SAH組兔基底動脈血流速度的平均值分別為：（ 28.71±2.6）cm/s、（27.2±3.1）cm/s、

（51.8±4.9）cm/s。DSA測得的空白對照組、實驗對照組、SAH組兔基底動脈管徑平均值分別為：（ 0.72±0.18）mm、（0.81±0.13）mm、（0.39±0.22）mm。經Student-Newman-Keuls檢驗對三組數據進行兩兩比較，SAH組與空白對照組、SAH組與實驗對照組TCD測得的基底動脈血流速度、DSA測得的基底動脈管徑值不等（P<0.05），空白對照組與實驗對照組TCD測得的基底動脈血流速度、DSA測得的基底動脈管徑值差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 免疫組化 每個標本取3張相同部位的切片，每張切片取不同的3個視野進行照像（Olympus光學顯微鏡，200倍），用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統測定PDEⅤ免疫表達物陽性反應產物IOD的SUM值表達，求其算術平均值。免疫組化測得的空白對照組、實驗對照組、SAH組兔基底動脈PDEⅤ表達分別為：（63.86±4.6）、（74.22±3.88）、（181.65±8.92）。經Student-Newman-Keuls檢驗對三組數據進行兩兩比較，SAH組與空白對照組、SAH組與實驗對照組SUM值不等（P<0.05），空白對照組與實驗對照組SUM值差異無統計學意義（P>0.05）。SAH組可見PDEⅤ在血管平滑肌內膜及中膜中明顯表達，空白對照組及實驗對照組中未見PDEⅤ明顯表達（圖5、圖6）。

3 討論

腦血管痙攣是蛛網膜下腔出血最嚴重的并發癥之一，可引起顱內壓增高，腦血流量降低、灌注不足，導致局部腦組織缺血或遲發性腦損害，是自發性蛛網膜下腔出血患者致死致殘的首要原因。本實驗采用經典的“枕大池二次注血法”制成兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣模型，用TCD和DSA證實腦血管痙攣發生后，將動物模型的基底動脈制成病理切片，通過免疫組化測定腦血管痙攣動物模型基底動脈中PDEV的表達，從而判定其與腦血管痙攣發生的關系。實驗證實制模成功后24 h腦血管痙攣即開始出現，3 d時腦血管痙攣的表現達到峰值。該結果與相關文獻報道相符合[3]。

磷酸二酯酶（phosphodiesterases，PDEs）是人體生理代謝活動中一種重要的酶[4]，廣泛分布于人體各個組織器官的細胞內，其作用主要是通過催化環核苷酸水解而改變細胞內cAMP及cGMP濃度。后兩者是細胞生理代謝活動中重要的第二信使，通過其濃度及活性調節細胞的重要功能。細胞內cAMP和cGMP水平變化主要與以下三種酶有關：腺苷酸環化酶（AC）、鳥苷酸環化酶（GC）和磷酸二酯酶（PDEs），這三種酶的濃度及活性調節變化，使細胞內cAMP和cGMP水平發生改變，從而產生相應的功能。磷酸二酯酶包括11種同工酶類型，不同磷酸二酯酶同工酶有著不同的調節機制及底物選擇性[5]。PDEIV、VII、VIII主要水解cAMP，PDEV、VI、IX主要水解cGMP。PDEⅤ與血管關系最為密切，其含量減少可使血管擴張，其抑制劑已經被廣泛應用于臨床 [6]。

血管源性舒張因子可作用于血管內皮細胞，激活腺苷酸環化酶（AC）或鳥苷酸環化酶（GC），后兩者可分別水解ATP、GTP生成cAMP和cGMP，cAMP可抑制蛋白激酶A活性，使血管平滑肌細胞舒張；cGMP能使細胞膜上的Ca2+通道關閉、肌漿網上Ca2+泵激活，使細胞內游離鈣減少，平滑肌舒張[7]。根據以上機理，增加血管平滑肌細胞中cAMP和cGMP濃度（如硝普鈉）、減少cAMP和cGMP降解（應用PDEs抑制劑如罌粟堿）都可以使血管舒張[8-9]。SAH后血管原性舒張因子減少，PDEs表達增多、活性增強，使血管平滑肌細胞中cAMP和cGMP生成減少、降解增加而導致其濃度降低，引起血管平滑肌收縮，發生腦血管痙攣。對SAH動物模型研究發現：模型動物基底動脈PDEⅤ表達較對照組明顯增多，應用枸櫞酸西地那非（PDEⅤ抑制劑）后，造影證實CVS得到緩解，認為血管平滑肌細胞中PDEⅤ表達增多與SAH后CVS發生有關，其抑制劑可以緩解CVS。目前臨床應用緩解血管痙攣的硝普鈉、罌粟堿效果均比較肯定。目前國外已將米力農（PDE III抑制劑）、西地那非（PDEⅤ抑制劑）應用于臨床，治療腦血管痙攣，效果肯定且無不良反應。另外PDEs抑制劑可擴張血管，改善循環，也被用于治療陽痿[10]、肺動脈高壓[11]。

本實驗證實兔蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的基底動脈中PDEV廣泛表達，表達部位主要集中在內膜和中膜，而對照組標本中均未見PDEⅤ明顯表達，通過計數軟件分析，兩者差異有統計學意義（P<0.05），因此推測PDEⅤ與蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣發生有關。PDEⅤ抑制劑可能對腦血管痙攣治療有效，可能成為治療蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的新一代藥物。

參考文獻

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（本文編輯：陳丹云）