大鼠心肌缺血再灌注后結蛋白的變化

【摘要】 目的：探討缺血再灌注損傷后大鼠心肌細胞內結蛋白分布狀況與含量的變化。方法：30只成年健康雄性SD大鼠，隨機分為缺血組、缺血再灌注組及假手術組。缺血組實施手術結扎冠狀動脈30 min后即刻取材，再灌注組缺血后再灌注120 min后取材，假手術組實施同樣的手術過程但不結扎。應用免疫熒光標記技術和圖像定量分析方法對大鼠心肌細胞結蛋白分布及含量的變化進行研究。結果：缺血組和缺血再灌注組心肌結蛋白在心肌細胞內的分布較假手術組的有序分布發生改變，變得無序而紊亂，心肌纖維橫紋不再清晰，變得斷續而模糊。缺血組和缺血再灌注組心肌結蛋白含量顯著低于對照組（P<0.05），缺血再灌注組顯著低于缺血組（P<0.05）。結論：心肌缺血和缺血再灌注均可造成心肌細胞結蛋白發生不同程度的降解，使心肌細胞骨架結構繼發破壞，這可能是心肌機械功能異常的解剖學基礎。

【關鍵詞】 心肌； 缺血再灌注； 結蛋白

Changes of Desmin after Rat Myocardial Ischemia Reperfusion/BAI Xue-mei.//Medical Innovation of China，2013，10（26）：006-008

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of ischemia reperfusion rat myocardial desmin distribution and content change.Method：30 healthy adult male SD rats were divided into ischemia group，ischemia reperfusion group and sham operation group.The ischemia group immediately sampled after the operation of coronary artery was ligated of 30 min，the reperfusion group sampled after reperfusion 120 min，the sham operation group to implement the same operation without ligation.Immunofluorescence staining and image quantitative analysis method were used to study the changes of myocardial desmin distribution and content in rats.Result：The myocardial desmin distribution of ischemia group and ischemia-reperfusion group became disordered，myocardial fiber stripes became blurred.Ischemia group and ischemia-reperfusion group myocardial desmin content was significantly lower than that in the control group （P<0.05），ischemia reperfusion group was significantly lower than that in ischemia group （P<0.05）.Conclusion：Myocardial ischemia and ischemia reperfusion injury can cause myocardial cell desmin degraded，the cytoskeleton structure was destroyed，which may be the anatomical basis of myocardial mechanical dysfunction.

【Key words】 Myocardium； Ischemia reperfusion； Desmin

First-author’s address：The Eighth Hospital of Baotou City，Baotou 014040，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.26.003

缺血組織恢復血流灌注時，導致再灌注區細胞和局部血管網顯著的病理生理變化，這些變化共同作用可促進進一步的組織損傷，該病理過程稱為缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）。缺血心肌的再灌注損傷可通過一定的病理學機制導致某些執行特定功能的蛋白質的降解和表達異常，繼發心肌細胞超微結構的改變，從而影響心肌正常的生理功能[1]。結蛋白（desmin）為細胞骨架蛋白，大量存在于心肌細胞內，結蛋白中間絲將Z帶與細胞膜及細胞核相連接，這些細絲對肌絲的組成和細胞結構的維持有重要作用。有研究發現，結蛋白對于維持肌肉正常的機械功能是必需的，結蛋白的破壞或表達異常可能造成肌肉機械功能的障礙[2]。

本研究制定了缺血再灌注實驗動物模型，觀察實驗大鼠在缺血后即刻和再灌注后心肌結蛋白分布狀況及含量的變化，試圖為探討缺血后及缺血再灌注后心肌損傷及其機械功能異常的發生機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選用健康成年雄性SD品系大鼠30只，體重（260±8）g。將選用大鼠隨機分為缺血組、缺血再灌注組和假手術組，每組10只。兩組大鼠體重比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 缺血再灌注組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（1 ml/100 g體重）麻醉，利用氣管插管接鼠類動物呼吸機進行人工呼吸（潮氣量20 ml/kg，頻率60～80次/min），心電監護儀監測其心電變化。開胸后于左冠狀動脈前降支起始2～3 mm處用4.0手術縫合線穿過動脈深面備用，用一細小柔軟膠片墊于血管與結扎線之間，待呼吸、血壓平穩15 min后結扎，30 min后剪除結扎線再灌注120 min后處死大鼠。結扎成功參照標準：結扎點遠端動脈分布區域心肌顏色發紺，心電圖QRS波群增高增寬，ST段抬高。再灌注成功參照標準：缺血部位心肌顏色恢復至正常水平，抬高的ST段至少下降50%。缺血組結扎30 min后即刻處死取材。假手術組手術過程參照實驗組，差別是在穿線后不結扎，30 min后取下縫合線，關閉胸腔，120 min后處死大鼠。

1.2.2 大鼠心肌取材切片 處死大鼠后迅速取出心臟，生理鹽水清洗后迅速于梗死區域（假手術組在相同區域）切取心肌組織，置于冰凍切片機專用標本盤，滴加OCT包埋劑后連同標本盤迅速置于液氮內冷凍20 s后轉入冰凍切片機切片箱，切取7 μm厚的冰凍切片置于-70 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.3 心肌冰凍切片的免疫熒光染色 結蛋白于心肌細胞內及閏盤處表達，選用FITC熒光標記，具體步驟如下：（1）將冰箱保存的冰凍切片取出，室溫復溫30 min后用4 ℃丙酮液固定10 min，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（2）滴加10%正常山羊血清封閉，室溫下孵育10 min；（3）傾去血清后勿洗，滴加經PBS 1：100稀釋的小鼠抗大鼠結蛋白抗體，4 ℃過夜，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（4）滴加經PBS 1：100稀釋的FITC標記兔抗小鼠IgG，37 ℃下孵育1 min，用PBS緩沖液漂洗3次，5 min/次；（5）滴加60%的緩沖甘油封片。

1.2.4 免疫熒光圖像的采集和分析 使用Leica AS MDW激光共聚焦成像工作站采集結蛋白的免疫熒光標記圖像，所有圖像均采用同一曝光時間及相同的條件采集。每張切片于缺血區域隨機選取心肌縱切視野5個，將數字圖像儲存以待分析。應用JD801圖像分析系統對數字圖像進行定量分析，測定結蛋白陽性表達部位的積分灰度值，以積分灰度值的大小代表結蛋白表達量的多少，對缺血再灌注損傷后心肌結蛋白進行定量分析。

1.3 統計學處理 圖片定量分析采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠心肌結蛋白免疫熒光圖像 圖1為假手術組心肌縱切的結蛋白免疫熒光標記圖像，綠色點狀和塊狀熒光斑即為結蛋白，可見假手術組心肌結蛋白在心肌細胞的胞漿內均勻的分布，在心肌細胞閏盤處分布增多，圖片中可見心肌纖維橫紋清晰。圖2和圖3為缺血后即刻和再灌注后120 min后的結蛋白免疫熒光圖像，可見在不同心肌細胞或者同一心肌細胞的不同部位結蛋白分布不再均一，呈現局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清。

2.2 大鼠心肌結蛋白的免疫熒光圖像定量分析 經計算機軟件的定量分析，假手術組缺血區結蛋白含量為（2 317 358±

329 937），缺血組缺血區結蛋白含量為（2 168 051±305 137），

缺血再灌組缺血區結蛋白含量為（1 986 050±335 629）。由此可得，缺血組和缺血再灌注組心肌結蛋白含量顯著低于假手術組，缺血再灌注組心肌結蛋白含量顯著低于缺血組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

圖1 正常心肌（假手術組）結蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：綠色點狀或塊狀熒光斑為結蛋白，可見結蛋白均勻分布于心肌細胞內，在閏盤處分布增多，心肌纖維橫紋清晰可見

圖2 缺血組心肌結蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：結蛋白分布不再均一，呈現局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清

圖3 缺血再灌注組心肌結蛋白免疫熒光圖像 （×200）

注：結蛋白分布不再均一，呈現局部或增多或減少甚至缺失，兩組心肌纖維橫紋亦變得模糊不清

3 討論

在心肌細胞，結蛋白（desmin）中間絲主要存在于Z帶和閏盤，排列成相互交錯的三維網狀結構，將Z帶與細胞膜及細胞核連接，從而使眾多的單個肌原纖維連接起來，將所有肌原纖維的單個收縮運動機械地整合在一起，形成合力。同時，結蛋白在細胞內收縮蛋白間架起或平行或交錯的網絡框架結構，使收縮力沿纖維軸方向傳遞，限制肌節在肌肉收縮過程中被過度牽拉。有學者利用結蛋白基因敲除小鼠模型證明結蛋白缺失可導致心肌細胞超微結構異常改變、心肌細胞凋亡以及心肌機械功能障礙，這表明結蛋白對于維持心肌細胞超微結構、保證心肌正常機械功能功能是必需的[3]。

陳小波等[4]研究發現，心肌挫傷后早期以細胞的機械損傷為主，之后細胞內Ca2+濃度增高，繼而由其介導的心肌結蛋白降解增加。心肌缺血再灌注損傷后的病理改變與前者類似，細胞內鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的主要病理機制，超量Ca2+與執行特定功能的各種相關蛋白結合導致心肌細胞凋亡啟動以及損傷的心肌細胞進行電重構，還可導致細胞膜相結構的破壞[5]。心肌缺血再灌注損傷后由于Ca2+激活了某些細胞骨架蛋白的降解，心肌細胞超微結構受到損壞從而導致心肌機械功能的異常，即心肌頓抑。心肌頓抑（myocardial stunning）系指心肌缺血再灌注后，即使沒有不可逆損害，即使冠脈血流恢復或接近正常水平，但仍持續存在的心肌機械功能異常，此種功能障礙是完全可逆的，只要給予足夠的時間，心肌機械功能就可以完全恢復。由此可見，心肌頓抑是由于心肌缺血再灌注造成的可逆性損傷[6-9]。研究發現，在發生頓抑的豚鼠心肌內，由于Ca2+激活了細胞內的鈣激活蛋白酶從而導致了心肌收縮功能障礙，致使諸如結蛋白、血影蛋白及α-輔肌蛋白等Z線相關蛋白的含量減少，從而反過來證明結蛋白等Z線相關蛋白的降解在心肌頓抑的發生中行使了重要的作用[10-11]。

實驗結果顯示，缺血組和缺血再灌組心肌結蛋白的分布狀況發生了很大的變化，可見在不同心肌細胞或者同一心肌細胞的不同部位結蛋白分布不再均一，呈現局部或增多或減少甚至缺失，心肌纖維橫紋亦變得模糊不清。兩組心肌結蛋白含量顯著下降，缺血再灌注組心肌結蛋白含量下降更為明顯，這說明缺血后心肌結蛋白發生了一定程度的降解，而缺血后的再灌注則加重了心肌的損傷促進了結蛋白的降解。心肌的缺血再灌注損傷可造成心肌結蛋白的大量降解，致使細胞骨架結構遭到嚴重破壞，從而導致心肌機械功能的暫時障礙，即心肌頓抑。缺血再灌注后心肌結蛋白的降解造成心肌細胞骨架三維結構的破壞，而細胞骨架通過錨定諸如線粒體、細胞核、肌絲、高爾基體等亞細胞結構來維持細胞的穩定性，細胞骨架結構的破壞可能使細胞膜以及其他細胞器對各種損傷因子的敏感性增強，使細胞更易受到這些損傷因子的攻擊而損傷；也就是說結蛋白的降解既是心肌缺血再灌注損傷的一個結果，又是心肌損傷進一步發展進而導致心肌機械功能障礙的因素。

心肌缺血再灌注損傷可造成心肌結蛋白的降解，從而改變結蛋白在心肌細胞的分布狀況，即原有的均勻分布的模式轉變為部分心肌結蛋白減少或缺失，心肌纖維橫紋變得模糊不清。結蛋白的降解導致心肌細胞骨架結構遭到破壞。心肌缺血再灌注后心肌結蛋白的上述改變可能是導致的心肌機械功能異常的解剖學基礎。

參考文獻

[1]李輝，石涵，朱天民，等.紅豆杉多糖對犬心肌缺血再灌注損傷模型心肌組織損傷及超微結構的影響[J].中華中醫藥雜志，2012，27（1）：219-223.

[2] Sjuve R，Arner A，Li Z，et al.Mechanical alterations in smooth muscle from mice lacking desmin[J].J Muscle Res Cell Motil，1998，19（4）：415-429.

[3] Milner D J，Taffet G E，Wang X，et al.The absence of desmin leads to cardiomyocyte hypertrophy and cardiac dilation with compromised systolic function[J].J Mol Cell Cardiol，1999，31（11）：2063-2076.

[4]陳小波，余祖濱，閔家新，等.大鼠心肌挫傷后細胞結蛋白破壞與鈣超載的實驗研究[J].第三軍醫大學學報，2011，33（10）：991-994.

[5]程永生，陳宇，李冬.鈣超載及其在心肌缺血/再灌注損傷中的作用機制研究現狀[J].中國醫學創新，2013，10（3）：150-151.

[6] Bolli R.Basic and clinical aspects of myocardial stunning[J].Prog Cardiovasc Dis，1998，40（6）：477.

[7] Kloner R A，Bolli R，Marban E，et al.Medical and cellular implications of stunning， hibernation，and preconditioning：An NHLBI workshop[J].Circulation，1998，97（18）：1848-1867.

[8] Braunwald E，Kloner R A.The stunned myocardium：prolonged，postischemic ventricular dysfunction[J].Circulation，1982，66（6）：1146-1149.

[9] Bolli R.Mechanism of myocardial “stunning”[J].Circulation，1990，82（3）：723-738.

[10] Matsumura Y，Saeki E，Inoue M，et al.Inhomogeneous disappearance of myofilament-related cytoskeletal proteins in stunned myocardium of guinea pig[J].Circ Res，1996，79（3）：447-454.

[11] Papp Z，van der Velden J，Stienen G J M.Calpain-I induced alterations in the cytoskeletal structure and impaired mechanical properties of single myocytes of rat heart[J].Cardiovasc Res，2000，45（4）：981-993.

（本文編輯：歐麗）