RNA干擾抑制大鼠肌腱細胞中V型膠原基因的表達

【摘要】 目的：利用RNA干擾技術（RNAi）下調肌腱細胞中V型膠原蛋白的表達，擬為后續探討V型膠原在損傷肌腱修復過程中的作用提供可行的試驗方法。方法：分別設計干擾大鼠V型膠原[COL5（ 1）2（ 2）]兩個亞基COL5 1和COL5 2表達的siRNA序列，轉染大鼠肌腱細胞。通過實時熒光定量PCR和免疫熒光法檢測V型膠原在基因和蛋白水平的表達。結果：轉染特定的siRNA后，V型膠原兩個亞基的基因表達被抑制約70%，蛋白表達也被明顯抑制。結論：RNAi法可有效地抑制大鼠肌腱細胞中V型膠原的基因和蛋白水平表達。為進一步研究V型膠原在肌腱損傷修復過程中的作用提供了可行的試驗方法。

【關鍵詞】 肌腱細胞； V型膠原； RNA干擾技術； 基因表達

年齡增長和運動過度均可造成肌腱韌帶損傷。目前臨床上的治療方法主要是理療和手術縫合。由于肌腱韌帶內細胞、血管較少，再生能力較差，所以愈后常由瘢痕組織修復，力學性能低下，易造成重復斷裂。

V型膠原在正常肌腱組織中含量很少，但在損傷肌腱中卻持續高表達52周[1]。有研究顯示過多的V型膠原抑制I型膠原的自聚生長。培養抑制了V型膠原功能的纖維細胞（Ehlers-Danlos Syndrome），其所產生的Ⅰ型膠原纖維直徑大于正常膠原纖維[2]。損傷肌腱修復后膠原纖維直徑明顯變小，而這些小直徑纖維又與肌腱修復后力學性能低下相關[3-4]。所以降低V型膠原的表達可能有利于促進大直徑膠原纖維的再生，提高損傷肌腱的修復效果。

RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）是近年興起的一種高效、特異阻斷靶mRNA表達而達到轉錄后基因沉默的新技術。能夠有效地抑制目的基因的表達，產生相應功能型缺失的現象，為研究特定基因功能提供良好的工具[5-6]。

本研究設計并合成干擾V型膠原兩個亞基的siRNA，轉染大鼠肌腱細胞，在基因和蛋白水平檢測抑制效率，篩選得到有效的干擾片段，為后續研究V型膠原的功能提供細胞水平平臺和可行的試驗方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、DMEM培養基（Gibco）；siRNA分子（Ambion）、LipofectamineTM2000轉染試劑；mMLV逆轉錄試劑（Invitrogen）、real time PCR試劑盒（TaKaRa）；V型膠原一抗（millpore）、熒光二抗。

1.2 儀器 二氧化碳培養箱；生物安全柜；倒置熒光電子顯微鏡（Olympus）；Real-Time PCR儀（ABI 7900 HT）。

1.3 實驗動物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄不限，體重250 g左右。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養 取大鼠跟腱，剝離肌腱腱膜，將組織塊剪成勻漿狀，用混合膠原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下（標準環境）進行原代培養。4～5 d更換1次培養基。當細胞鋪滿培養皿底約90%時，用胰蛋白酶消化按1：3進行傳代培養。取P5以內的細胞用于后續實驗。

1.4.2 siRNA序列設計 由Ambion公司設計與合成siRNA干擾序列。由于V型膠原的分子組成為COL5（ 1）2（ 2），所以分別設計了針對COL5 1和COL5 2亞基的siRNA序列，為實驗序列，見表1。并提供已知有效抑制GAPDH的siRNA作為陽性對照序列（positive control， PC），FAM綠色熒光標記的亂序siRNA為陰性對照序列（negative control， NC）。

1.4.3 基因轉染 將處于對數生長期的大鼠肌腱細胞按5×104/孔的密度接種于12孔板中，培養20 h后，更換無FBS的培養基后進行轉染。具體方法參照Lipofectamine TM2000轉染試劑說明書。培養6 h后更換含FBS的培養基。

1.4.4 實時熒光定量PCR法檢測基因干擾效率 肌腱細胞轉染特定的siRNA48 h后，收集肌腱細胞，提取RNA，采用兩步法完成反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）（n=3）。采用b-actin做內參，用實時熒光定量PCR法（real time PCR）定量分析COL5 1和COL5 2基因的表達，所用引物見表2。

1.4.5 免疫熒光法檢測蛋白抑制效率 由于亂序的siRNA自身標記FAM綠色熒光，不能用作陰性對照，所以用只加轉染試劑而不加任何siRNA的肌腱細胞作為對照組（Control）（n=3）。肌腱細胞轉染72 h后，去掉培養基，PBS潤洗，固定，加入稀釋好的一抗，置于濕盒中4 ℃過夜（為扣除背景熒光，以不加一抗的肌腱細胞作為免疫熒光的方法學對照）。次日，PBS潤洗，加入熒光標記的二抗，室溫避光1 h。再次用PBS潤洗，熒光電子顯微鏡下觀察結果。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.5統計軟件對數據進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA轉染效率檢測 體外培養肌腱細胞見圖1A。轉染特定的siRNA后，用熒光顯微鏡觀察陰性對照組肌腱細胞，結果見圖1B。肌腱細胞內充滿綠色熒光，表明FAM標記的siRNA進入肌腱細胞內，轉染效率較高。

注：體外培養大鼠肌腱細胞（圖1A）；轉染FAM熒光標記siRNA的肌腱細胞（圖1B）

2.2 靶向siRNA抑制V型膠原在mRNA水平的表達 肌腱細胞轉染siRNA48 h后，用real time PCR法檢測COL5 1和COL5 2在基因表達的水平，見圖2。與陰性對照組（亂序siRNA）相比， 1（V）實驗組（siRNA196227）有效抑制了肌腱細胞中COL5 1基因水平的表達， 2（V）實驗組（siRNA s136862）有效抑制了肌腱細胞中COL5 2基因水平的表達。抑制程度約70%左右（P<0.05）。陽性對照組（抑制GAPDH的siRNA）有效抑制了GAPDH的表達（數據未展示）。設置陽性對照組目的為驗證siRNA轉染方法的有效性，見圖2。

2.3 靶向siRNA抑制V型膠原在蛋白水平的表達 肌腱細胞轉染siRNA72 h后，用免疫熒光法檢測肌腱細胞中V型膠原蛋白水平的表達，見圖3。 1（V）實驗組（siRNA196227）有效抑制了肌腱細胞中Col5 1在蛋白水平的表達（圖3A）， 2（V）實驗組（siRNAs136862）有效抑制了肌腱細胞中Col5 2在蛋白水平的表達（圖3E）。

注： 1（V）：實驗組1（大鼠肌腱細胞轉染siRNA196227）； 2（V）：實驗組2（大鼠肌腱細胞轉染siRNA s136862）；PC：陽性對照（大鼠肌腱細胞轉染干擾GAPDH的siRNA）；NC：陰性對照（大鼠肌腱細胞轉染FAM標記的亂序siRNA）（圖2A，圖2B）

注：V型膠原亞基Col5 1在蛋白水平的檢測（圖3A～3C）；V型膠原亞基Col5 2在蛋白水平的檢測（圖3D～3F）； 1（V）：實驗組1（大鼠肌腱細胞轉染siRNA196227）； 2（V）：實驗組2（大鼠肌腱細胞轉染siRNA s136862）；Control：空白對照組（大鼠肌腱細胞只加轉染試劑，不加任何siRNA）

3 討論

有研究表明損傷肌腱中V型膠原表達異常升高[1]，且過多的V型膠原抑制I型膠原的自聚生長。本實驗在體外培養大鼠肌腱細胞，利用RNAi法抑制肌腱細胞中V型膠原兩個亞基COL5 1和COL5 2的表達。結果表明，化學合成的siRNA分子通過脂質體轉染大鼠肌腱細胞后，有效抑制了COL5 1和COL5 2在基因水平的表達，V型膠原在蛋白水平的表達也明顯降低。表明RNAi法可以有效抑制V型膠原在肌腱細胞中的表達。為后續研究V型膠原在肌腱損傷修復過程中的調節作用提供可行的試驗方法。也為促進損傷肌腱再生，達到結構和功能的完全恢復帶來潛在的基因治療手段。

參考文獻

[1] Frank C， McDonald D， Shrive N. Collagen fibril diameters in the rabbit medial collateral ligament scar： A longer term assessment [J]. Connect Tissue Res，1997，（36）：261-269.

[2] Wenstrup R J， Florer J B， Cole W G， et al. Reduced type I collagen utilization： a pathogenic mechanism in COL5A1 haplo-insufficient Ehlers-Danlos syndrome [J]. J Cell Biochem， 2004，92（1）：113-124.

[3] Goh J C， Ouyang H W， Toh S L， et al. Tissue engineering techniques in tendon and ligament replacement [J]. Med J Malaysia，2004，59（l）：47-48.

[4] Hui J， Ouyang H W， Goh J， et al. Application of mesenchymal stem cell for musculoskeletal tissue engineering [J]. Ann SG Acad Med，2005，34（2）：206-212.

[5] Fire A， Xu S， Montgomery M K， et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditiselegans [J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.

[6] Elbashir S M， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells [J]. Nature，2001，411（6836）：494-498.

（收稿日期：2013-05-20） （本文編輯：王宇）