減毒麻疹病毒誘導子宮內膜腺癌細胞凋亡及其機理

【摘要】 目的：探討體外感染減毒麻疹病毒（MV）對子宮內膜腺癌細胞（JEC）的凋亡誘導作用及相關機理。方法：MTT比色法動態監測MV感染對JEC細胞增殖活力的影響；瓊脂糖凝膠電泳以及流式細胞術檢測細胞凋亡；免疫細胞化學法檢測MV感染后JEC細胞的Fas、FasL及TGF-β表達，分析凋亡機制。結果：MV感染6 d內，促進細胞的生長；感染6 d后，抑制細胞的生長，最終造成細胞死亡。流式細胞術結果顯示：各感染濃度組JEC細胞的凋亡率比正常對照組增高（P<0.05或P<0.01），隨感染時間的延長，細胞的凋亡率呈上升的趨勢，感染12 d時，凋亡率與感染濃度呈正相關（r=0.77），且瓊脂糖凝膠電泳出現特征性DNA“Ladder”凋亡條帶；此時，感染細胞內Fas及TGF-β的表達增強（P<0.01），而FasL始終未表達。結論：MV感染能夠抑制JEC細胞增值，并誘導其凋亡，JEC細胞凋亡機制可能與Fas、TGF-β的表達有關。

【關鍵詞】 減毒麻疹病毒； 子宮內膜腺癌細胞； 細胞凋亡； Fas； FasL； TGF-β

子宮內膜癌是發生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，以來源于內膜腺體的腺癌最常見。為女性生殖道三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%。近年來發病率在世界范圍內呈上升趨勢。早期患者預后較好，而晚期患者多有盆腔外轉移，預后差，雖然采用手術、放射、藥物等綜合治療，但5年生存率仍較低，因此尋找新的治療方法迫在眉睫 [1]。溶瘤病毒治療是近年來興起的一種新的腫瘤治療途徑，其機制在于利用基因工程對病毒進行改造，使其在腫瘤中選擇性復制并產生溶瘤作用[2]。病毒溶瘤結合其他治療，使得腫瘤治療的療效顯著提高，得到我國政府的重視，不斷加大投入，相繼啟動了一些與溶瘤病毒學密切相關的重大研究項目。麻疹病毒（MV）感染可誘導多種細胞凋亡，利用MV這一感染特性，有研究人員開展了利用MV治療淋巴瘤、腦腫瘤、卵巢癌等的研究，并獲得了較好的療效[3-7]。尤其是利用基因重組的MV-CEA、MV-NIS（MV與放射性碘化鈉的重組體）治療卵巢癌的方法已用于一期臨床試驗[6-7]。JEC是一株人子宮內膜腺癌細胞系，研究證實子宮內膜腺癌細胞表面表達麻疹病毒結合受體CD46[8]。因此設想麻疹病毒是否對子宮內膜腺癌有抑制作用；其抑制作用是否通過誘導細胞凋亡實現？因此，本實驗通過不同濃度的MV感染JEC細胞，然后觀察不同感染濃度及時間細胞的增值及凋亡情況，并對病毒感染前后細胞Fas、FasL、TGF-β的表達進行測定，初步探討MV對JEC的抑制作用及其相關機理，為利用MV對子宮內膜癌進行溶瘤治療的進一步研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 麻疹病毒疫苗京160（北京天壇生物制品股份有限公司）；JEC細胞（遵義醫學院微生物教研室）；Annexin-v FITC/PI試劑盒（晶美生物工程公司）；兔抗Fas、兔抗FasL、兔抗TGF-β（Santa Cruz公司）；小量凋亡DNA抽提試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病毒感染濃度的選定 TCID50測定按照中國生物制品規程操作，對病毒進行倍比稀釋，接種JEC細胞，每個稀釋度設4復孔，并設空白對照，置37 ℃、相對濕度97%、5% CO2孵箱中連續培養，觀察7 d，以第7天感染細胞出現2孔或2孔以上多核巨細胞病變的病毒的最高稀釋度作為病毒效價。

1.2.2 MTT檢測 用96孔板接種細胞，待細胞貼壁伸展生長后，MV感染細胞，每個稀釋度設6復孔，并設正常對照。感染后第1～10天分別進行MTT檢測。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 按DNA提取試劑盒說明書提取經病毒感染12 d（根據預實驗結果）的JEC細胞DNA，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，條件為60 V，4 h，然后使用凝膠成像分析系統檢測電泳結果并拍照。

1.2.4 流式細胞術 于病毒感染后一定時間收集細胞，按Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書進行操作，制備樣品，上機檢測細胞凋亡率。

1.2.5 免疫細胞化學法檢測細胞凋亡機理 收集MV感染后12 d的細胞，進行石蠟包埋、切片，進行切片的免疫組化實驗，觀察細胞Fas、FasL以及TGF-β的表達變化，進行吸光度值的比較。設陰性對照、正常對照、病毒組。

1.3 統計學處理 采用SPSS 12.0軟件對所得數據進行統計分析，兩變量的相關性以相關系數（r）值確定，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒TCID50 病毒TCID50的稀釋度為1：160，本研究擬采用1：80、1：40、1：20、1：10四個稀釋度作為感染濃度。

2.2 MTT檢測 抑制率=1-（病毒組OD/正常對照組OD），見表1。每個稀釋度設6復孔，同一感染濃度條件下，病毒感染時間與抑制率呈正相關（P<0.01）。感染后6 d內，病毒對細胞的生長表現為促進作用；而6 d后，開始出現抑制作用，同一感染濃度，各濃度組不同感染天數的組間均存在著差異（P<0.05或P<0.01），9、10 d抑制率與感染濃度呈正相關

2.3 凋亡特征性 DNA “Ladder”條帶的形成在1：10、1：20、1：40稀釋度出現了凋亡特征性的“Ladder”條帶，而對照組無明顯的DNA“Ladder”條帶的出現，見圖1。

圖1 MV感染后JEC細胞DNA電泳結果

注：M：marker；1：陰性對照；2～4：1：10、1：20、1：40稀釋度感染12 d

2.4 流式細胞儀檢測JEC凋亡率的結果 每個稀釋度設3復瓶培養，同一感染濃度條件下，隨感染時間的延長，細胞凋亡率逐漸上升，兩者為正相關。同一時間點與對照組比較，病毒組的細胞凋亡率升高（P<0.05或P<0.01），感染后12 d，感染濃度與凋亡率呈正相關，見表2。

2.5 免疫細胞化學法檢測JEC細胞Fas、FasL以及TGF-β表達結果

2.5.1 Fas的表達 鏡下Fas陽性染色主要位于細胞漿中，每組取8個不同視野進行光密度值測定，與正常對照組相比，病毒組Fas陽性反應強度增加，染色變深；正常對照組與陰性對照組相比，染色變深。經圖像分析系統軟件分析各組的平均吸光度值，結果顯示與陰性對照組相比，正常對照、病毒組的平均光密度值降低。各組間比較差異顯著（P<0.01），見表3。

2.5.2 FasL的表達 每組取8個不同視野進行光密度值測定，鏡下觀察FasL在陰性對照組、正常對照組、病毒感染組中均無表達。比較各組平均光密度值，各組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

2.5.3 TGF-β的表達 每組取8個不同視野進行光密度值測定，鏡下陰性對照組、正常對照組均不表達，病毒組陽性染色主要位于細胞漿內，經圖像分析系統軟件分析各組的平均光密度值。結果顯示：與陰性對照組比較，正常對照組光密度值降低不明顯，組間差異無統計學意義（P>0.05）；病毒組與上述兩組相比平均光密度降低，組間比較差異有顯著統計學意義（P<0.01）。

3 討論

MV為單股負鏈RNA病毒，H、F和N（核蛋白）三種蛋白是麻疹病毒的主要抗原成分，MV通過CD46、SLAM（淋巴活化信號分子）、DC-SIGN（C-血凝素細胞間粘附分子）受體介導病毒的感染及傳播，CD46是麻疹疫苗株和麻疹病毒實驗室株的主要細胞受體[9-12]。SLAM在有活性的T 和B細胞表面上表達，是新發現的麻疹病毒細胞受體[13]。麻疹野生病毒、實驗室株和麻疹疫苗株都能在有表達SLAM的細胞上產生典型的病變，誘導細胞凋亡，因此MV在人類腫瘤的溶瘤治療中具有廣泛的應用前景，其抗瘤譜包括多種淋巴、非淋巴人類惡性腫瘤。在婦科腫瘤中，國外已經將基因改造的MV應用于卵巢癌的I期臨床試驗[6-7]。國內亦有研究證實麻疹減毒活疫苗體外可抑制原代卵巢癌細胞生長，引起細胞病變和細胞凋亡，另有研究顯示MV減毒株在組織培養中和裸鼠體內對HeLa人宮頸癌腫瘤有明顯的殺傷作用，因此減毒MV疫苗株在婦科腫瘤中有很好的應用前景[14-15]。本研究將減毒麻疹疫苗感染人子宮內膜腺癌細胞，感染后6 d，亦表現為抑制細胞的生長，并誘導細胞凋亡，且細胞凋亡率與病毒的感染時間及感染濃度有關，由此，筆者推測MV抑制細胞生長可能是通過誘導細胞凋亡實現的。但是，在病毒感染6 d內，病毒對細胞的生長表現為促進作用，病毒濃度越高，其促進作用越強。推測其可能的原因是細胞感染早期，無細胞膜及線粒體膜的破裂，細胞相互融合，使線粒體的功能加強，還原MTT形成藍紫色的甲臢結晶增多，導致OD值升高；也可能是MV感染初期細胞分泌促生長物質，使細胞生長加快。但這種推測，還有待進一步實驗證明。總之，MV最終抑制JEC的生長，并誘導感染細胞的凋亡，可進一步用于人子宮內膜腺癌治療的實驗研究。

通過MV感染DC細胞的研究證明，人類DC細胞的凋亡是通過Fas/FasL介導[16]。另外，MV可通過誘導體外培養的外周血單核細胞（PBMC）Fas的表達，間接引起未感染MV但表達FasL的旁觀者T細胞凋亡[17]。TGF-β既能增強某些細胞的增殖、分化能力，又能誘導某些細胞的凋亡反應，如TGF-β可誘導淋巴細胞、肝細胞、肝癌細胞、子宮上皮細胞凋亡及猴免疫缺陷病毒感染所致的B細胞淋巴瘤細胞的凋亡[18]。病毒感染可使TGF-β的表達增加，活性增強，促進凋亡的發生。實驗結果顯示，MV感染后12 d，各組細胞的凋亡率增至最高，并出現DNA Ladder凋亡條帶，此時病毒組Fas、TGF-β的表達均增加，而FasL在正常對照及病毒感染組始終未表達。提示MV誘導JEC凋亡的機制可能與Fas及TGF-β的表達有一定的關系，但FasL不表達的原因仍有待今后進一步探討。

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（收稿日期：2013-07-15） （本文編輯：歐麗）