吸毒者淋巴細胞基因組甲基化水平與T淋巴細胞亞群變化的相關性分析

【摘要】 目的：探討康復期強制戒毒人員淋巴細胞基因組DNA甲基化水平和T細胞亞群間的相關性。方法：抽提康復期強制戒毒人員和正常人淋巴細胞基因組DNA，采用整體甲基化定量試劑盒檢測基因組DNA甲基化水平；T細胞亞群檢測采用流式細胞術。結果：分別對80例康復期強制戒毒人員和正常健康人群進行淋巴細胞基因組DNA甲基化水平檢測發(fā)現(xiàn)，康復期強制戒毒人員淋巴細胞基因組DNA甲基化百分率為（15.37±3.28）%，顯著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。康復期強制戒毒人員CD3+、CD3++CD4+和CD3++CD4+/CD3++CD8+均明顯低于正常健康人群（P<0.05）。且CD3+、CD3++CD4+與淋巴細胞基因組DNA甲基化水平呈正相關（r=0.21，0.36，P<0.05）。結論：康復期強制戒毒人員淋巴細胞基因組DNA甲基化水平顯著低于正常人水平，其淋巴細胞基因組DNA甲基化水平和CD3+、CD3++CD4+明顯相關。

【關鍵詞】 毒品； 甲基化； 淋巴細胞； 細胞免疫

人體免疫系統(tǒng)是由多種免疫細胞、免疫分子共同參與，形成復雜的網(wǎng)絡結構而發(fā)揮作用。其中淋巴細胞對免疫應答的啟動起著至關重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，吸毒人群的免疫系統(tǒng)受到極大破壞，淋巴細胞的活性也受到破壞[1]。而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎等自身性免疫疾病中，均發(fā)現(xiàn)其淋巴細胞DNA甲基化水平發(fā)生異常[2]。吸毒所導致的免疫力低下，與淋巴細胞甲基化水平是否存在特定規(guī)律，這是本研究的主要著眼點。本研究通過檢測康復期強制戒毒人員外周血淋巴細胞基因組DNA甲基化水平和T淋巴細胞亞群變化，研究吸毒者免疫力受損與DNA甲基化的關聯(lián)，為探討毒品對免疫病理損傷可能機制提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本試驗于2002年9月-2002年12月間進行。以80例康復期強制戒毒人員為研究對象，其來源于福建省司法廳所屬強制戒毒場所自愿參加戒毒的人員，男40例，女40例，平均年齡（32.16±0.98）歲；符合ICD-10阿片類藥物依賴診斷標準和苯丙胺類藥物依賴診斷標準的脫毒患者；經(jīng)告知同意，自愿參加，并簽署知情同意書；排除HIV、肺結核、肝炎等傳染性疾病患者，排除肝、腎、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群為對照，采集靜脈血樣，其來源于福建省二人民醫(yī)院健康體檢中心參加體檢且身體健康無重大疾病者，男40例，女40例，平均年齡（29.33±2.41）歲。兩組在性別、年齡方面比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 主要儀器和試劑 多功能酶標儀Infinite M200 F200（奧地利TECAN）；流式細胞分析儀EPICS XL（美國Coulter）；超低溫冰箱Premium Range（美國NBS）；超微量紫外分光光度計NANODROP2000（美國THERMO）；生化培養(yǎng)箱SHP-250（上海精宏）；臺式離心機（美國EPPENDORF）；可調式移液器（美國EPPENDORF）。

淋巴細胞基因組DNA抽提試劑盒（美國Omega公司）；整體甲基化定量試劑盒（美國Epigentek公司）；單克隆抗體（美國BD公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 外周血T淋巴細胞亞群檢測 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小試管底部，分別加20 μL熒光標記的單克隆抗體，混勻，室溫（18～25 ℃）孵育15 min。加紅細胞溶解液1 ml，充分混勻。待紅細胞完全溶解后上流式細胞儀檢測。在波長488 nm時，計數(shù)30 000個細胞。記錄分析直方圖，數(shù)據(jù)經(jīng)ELITE軟件處理，以百分率報告。

1.3.2 淋巴細胞基因組DNA的提取 被試人員在清晨空腹靜脈采血5 ml于EDTA抗凝管中。供試血樣淋巴細胞基因組DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美國Omega公司），按試劑盒說明進行，抽提的DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 DNA含量測定及純度鑒定 取抽提好的DNA溶于雙蒸水中，于超微量紫外分光光度計NANODROP2000（美國THERMO）上測量260/280 nm光密度值。保證供試樣本A260/280比值均在1.7～1.9之間，濃度在50～100 μg/ml，以用于整體DNA甲基化水平的測定。對不符合要求的DNA樣本重新進行抽提和定量。

1.3.4 淋巴細胞整體基因組甲基化水平測定 DNA整體甲基化水平采用整體甲基化定量試劑盒（美國Epigentek公司）檢測。該試劑盒采用抗原抗體結合的方法，將DNA固定到一個對DNA具有高親和力的反應孔中，甲基化的DNA能夠被5甲基胞嘧啶抗體識別，通過抗原抗體識別反應進行定量，甲基化的DNA與OD值的高低成正比。具體操作步驟按試劑盒說明書操作，DNA甲基化的程度采用如下公式計算：

甲基化%=OD（樣本-空白對照）/2×OD（陽性對照-空白對照）

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，相關性分析采用多元回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 整體DNA甲基化水平檢測結果 康復期強制戒毒人員淋巴細胞中基因組DNA甲基化百分率為（15.37±3.28）%，顯著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 T淋巴細胞亞群檢測結果 康復期強制戒毒人員CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明顯低于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；康復期強制戒毒人員CD3++CD8+與健康人相比雖有差異，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 淋巴細胞基因組DNA甲基化水平與T淋巴細胞亞群的相關性 以基因組DNA甲基化水平為因變量進行多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，CD3+、CD3++CD4+與淋巴細胞基因組DNA甲基化水平呈正相關（r=0.21，0.36，P<0.05）。CD3++CD8+、CD3++CD4+/CD3++CD8+與其無相關關系（P>0.05）。

3 討論

本研究表明吸毒者總T細胞（CD3+）減少，CD3++CD4+細胞也顯著降低，CD3++CD8+無顯著變化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明顯下降，說明毒品抑制吸毒者的正常免疫功能。毒品對人體細胞免疫的影響早有報道。早在1974年Brown等[3]就報道，海洛因成癮者免疫功能缺陷，表現(xiàn)為淋巴細胞轉化率顯著降低。海洛因廣泛抑制機體細胞免疫功能，使淋巴細胞增殖和活性受抑制[4-5]。同時還能引起T淋巴細胞對PHA刺激導致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整體細胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，其機制可能是海洛因等藥物毒性代謝產(chǎn)物抑制了T細胞的活性和增殖能力，也可能是長期濫用外源性阿片樣物質引起機體下丘腦神經(jīng)內分泌激素系統(tǒng)（阿片肽系統(tǒng)）退行性改變，使其對T細胞及其亞群的正常調節(jié)作用減退和消失導致細胞免疫功能受損[7]。

DNA甲基化是目前研究較為深入的一種表觀遺傳學調控機制。在近幾年研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起著重要作用。DNA甲基化水平改變可以影響許多基因的表達，包括一些與黏附因子和細胞因子表達相關的基因，導致T細胞的自身反應性發(fā)生改變，從而與疾病發(fā)病密切相關。如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）和系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因組普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通過引起患者的某些基因的異常表達，參與疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。

本文研究結果表明，康復期強制戒毒人員淋巴細胞基因組DNA甲基化水平顯著低于正常人水平，說明毒品對人體淋巴細胞DNA有一定影響，其表觀遺傳修飾發(fā)生改變。同時發(fā)現(xiàn)淋巴細胞基因組DNA甲基化水平與CD3+和CD3++CD4+呈正相關，說明吸毒所導致的細胞免疫功能下降與淋巴細胞基因組DNA甲基化水平存在關聯(lián)。本研究揭示了康復期戒毒人員的甲基化水平狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細胞免疫功能與淋巴細胞甲基化水平相關性，為今后從分子水平探索毒品對人體免疫病理損傷機制具有重要意義。

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（收稿日期：2013-08-20） （本文編輯：蔡元元）