發(fā)酵工程實驗—大腸桿菌pTwin1—A質粒的誘導表達

摘 要：為了實現(xiàn)轉化大腸桿菌BL21菌種的質粒pTWIN-A，并獲得鑒定該目的基因的表達蛋白。通過目標線性前體基因克隆到表達載體pTWIN1、重組表達質粒用熱休克法轉化BL21菌、用生物反應器培養(yǎng)發(fā)酵、IPTG誘導實現(xiàn) CBD-Inteinl-Target-Intein2-CBD的表達，采用SDS-PAGE鑒定重組蛋白。發(fā)現(xiàn)構建出了正確的重組表達質粒，轉化BL21后經誘導產生了約25KD的蛋白產物。得出了轉化BL21菌種的質粒pTWIN-A，獲得并鑒定了該目的基因的表達蛋白，為進一步研究目的蛋白與CBD蛋白一端結合或者兩端結合奠定了基礎。

關鍵詞：大腸桿菌；轉化；誘導；表達；蛋白產物

Target Gene插到MCS處，可以與CBD-Intein一端連接，也可以與CBD-Intein兩端連接，這種連接方式理論上應該是隨機的。當質粒與這些大腸桿菌混合后，質粒粘附在大腸桿菌的表面，在42℃時，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質粒可通過大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37℃震動培養(yǎng)可使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉化效率。轉化成功的大腸桿菌可以在相應抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。另外，RNA聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導表達后僅幾個小時，目的蛋白通常可以占到細胞總蛋白的50%以上。在培養(yǎng)體系中加入IPTG誘導RNA聚合酶生產，繼而質粒上的目的DNA 開始轉錄。本實驗擬用SDS-PAGE鑒定經IPTG誘導后的蛋白產物，來分析Target Gene與CBD-Intein的連接情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株 BL21菌株、pTWin1-A質粒。

1.1.2 試劑

（1）轉化主要試劑。LB培養(yǎng)基（1L：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g）、1.5%瓊脂、1：1000AMP、IPTG、PH計標定液、溶氧電極標定液（Na2SO3）。

（2）電泳主要試劑。丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、SDS、Tris、DTT、過硫酸銨、Tris-甘氨酸、TEMED、甘油、考馬斯亮藍R250、溴酚藍、醋酸、甲醇、乙醇、蛋白標準。

1.1.3 溶液配方

（1）分離膠（10mL）：30%Acr4.0mL，1.5mol/L PH 8.8的Tris+10%SDS共2.5mL，蒸餾水3.3mL，10%過硫酸銨100uL，TEMED4uL。

（2）濃縮膠（5mL）：30%Acr0.67mL，1.0mol/L PH 6.8的Tris+10%SDS共1mL，蒸餾水2.3mL，10%過硫酸銨50uL，TEMED4uL。

（3）染色液：90mL甲醇：水（1：1，V/V）和10mL醋酸混合+0.25R250，過濾可用。

（4）脫色液：90mL甲醇：水（1：1，V/V）和10mL醋酸。

（5）2*樣品緩沖液：100mL Tris.Cl（pH6.8），200mLDTT，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油。

（6）5*電泳緩沖液（1L）：Tris-Gly：15.1gTris+94gGly，50mL 10% （W/V） SDS。

1.2 方法

1.2.1 熱休克法轉化BL21菌。取50uL感受態(tài)菌液，加入構建的pTWIN1-AS質粒5uL，在冰上放置30min，用42℃水浴90秒，最后在冰上再放置2min，補加900uLLB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)1hr。取100uL轉化菌液涂在含Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)18hr。

1.2.2 觀察轉化結果。經過18hr左右的培養(yǎng)，平板上長出了379個菌。平板中央較為密集，周圍分布分散，生長情況良好，大小均勻。

1.2.3 接菌。用槍頭挑取2-3個單克隆接入50ml含Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基（250ml三角培養(yǎng)瓶），37℃過夜培養(yǎng)。

1.2.4 誘導表達

（1）將過夜培養(yǎng)物按1：1000轉接到3L含Amp抗生素（1：1000）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每隔1hr，取菌測量OD600及菌重，OD約為0.5時，取菌留樣（取500uL菌液，5000rpm RT 10min，棄上清，沉淀用200uLH2O重懸加入等體積2*LD，煮5-10min使其不粘稠，作為誘導前樣品-20℃保存）。

（2）按1：1000加入IPTG開始誘導表達，37℃培養(yǎng)半小時后取菌測量OD600及菌重并留蛋白樣品，此后每隔1hr，取菌測量OD600及菌重并留蛋白樣品（取500uL菌液，5000rpm RT 10min，棄上清，沉淀用200uLH2O重懸加入等體積2*LD，煮5-10min使其不粘稠，作為誘導后樣品-20℃保存）。

（3）將培養(yǎng)物取出，分裝至高速離心管內，5000rpm RT 10min，收菌-80℃保存。

（4）同樣的方法應用于100mL搖瓶的發(fā)酵。

1.2.5 SDS-PAGE電泳鑒定。根據所測定的蛋白質相對分子質量范圍，選擇適宜的分離膠濃度，本實驗宜選用12%的分離凝膠、4%的濃縮凝膠進行電泳分離。制凝膠板，加樣。加樣結束后，濃縮膠調80V，分離膠調120V，開始跑電泳。電泳結束后，切去濃縮膠，考馬斯亮藍染色2小時，脫色液脫色過夜，觀察跑出的條帶。

第一組發(fā)酵過程中接菌時小部分培養(yǎng)液溢出，未接入罐內；發(fā)酵131min時罐內溶氧低，通氣流量從3L/min調至4L/min，溶氧小幅回升；接菌135min時溶氧再次下跌，轉速調至200rpm，但實測轉速為159rpm，溶氧持續(xù)低位；接菌144min后裝置恢復，轉速調至400rpm，之后又調至500rpm，溶氧顯著改善；接菌175min后，加入IPTG誘導目的蛋白表達；誘導20min后溶氧低，空氣流量不足，去除排氣口濾器，溶氧顯著改善；誘導153min后罐內泡沫溢出，加入適量消泡劑，泡沫量回到正常；誘導270min后，收菌。其余時刻均正常培養(yǎng)發(fā)酵。第二組發(fā)酵時盡量避免了上述情況。

2 結果

2.1 轉化結果

2.4.3 蛋白質大小

3 討論

3.1 對實驗結果的分析

兩組實驗的結果都是得出了產物為25KD的蛋白，也就是目標蛋白與CBD+Intein蛋白一端連接的情況，通過后續(xù)的多次重復實驗表明3KD目標蛋白兩端結合22KD的CBD+Intein的47KD蛋白出現(xiàn)少于25KD，猜測可能是47KD的產物在操作時候斷裂了。從第二組的電泳結果看，出現(xiàn)了22KD的條帶，但是22KD的條帶只是CBD+Intein蛋白，它在轉化后理應不會單獨存在；47KD的條帶斷裂后產生了22KD條帶和25KD條帶，于是在第二組的實驗結果里看到了很模糊的在22KD出現(xiàn)的條帶。這也從側面說明47KD的條帶若是存在也是少量的。但這個觀點還需要進一步的實驗來論證。

3.2 發(fā)酵接菌失誤對結果影響的分析

實驗在發(fā)酵培養(yǎng)中出現(xiàn)了一個情況：第一組實驗在發(fā)酵罐接菌時并未全部接入罐內，損失了三分之一左右，所以從最后的產量看發(fā)酵罐比搖瓶低；第二組實驗則全部接入。按照常理，第一組既然少接了菌，那么菌體培養(yǎng)的時間可能要延長。但是從加入IPTG開始誘導的時間來看，第一組并未落后第二組很久，也就是說菌體的培養(yǎng)時間幾乎沒有延長。由此我們從下列情況來分析：

A、培養(yǎng)基。培養(yǎng)基都是實驗前一起配置的，所以這個因素不考慮。

B、滅菌情況。在第二組實驗時，在發(fā)酵罐底部發(fā)現(xiàn)了黑乎乎的雜質，可能是發(fā)酵罐沒洗干凈留下的污垢，可能是已死亡的大腸桿菌，如果是后者，那說明第二組實驗可能有雜菌的污染。

C、種子的質量。都是統(tǒng)一的BL21，都是經過篩選后得到的抗氨芐的大腸桿菌，這個因素也不考慮。

D、溫度及pH值。發(fā)酵罐培養(yǎng)的溫度及pH都是固定的，不考慮。

E、泡沫的影響。實驗過程中，第二組發(fā)酵罐內產生的泡沫明顯多于第一組，過多的泡沫會對體系造成影響：

①減少發(fā)酵的有效容積，若不加控制，過多的泡沫通過排氣管溢出，造成發(fā)酵液流失；②過多的泡沫從罐頂的軸封滲出罐外，這就增加了染菌的機會；③使部分菌體粘附在罐蓋或罐壁上，而失去作用；④泡沫嚴重時，影響通氣攪拌的正常進行，妨礙代謝氣的排出，對菌體呼吸造成影響，甚至使菌體代謝異常，影響生產率。

②和③可能導致了實驗時罐內出現(xiàn)黑乎乎的物質。

F、補料的影響。補料太少，細菌合成原料缺少；補料過多，發(fā)酵液被稀釋，所以應該選擇合適的時機加補料。實驗中補料都是機器自動控制的，第一組只加了少量消泡劑，第二組加的消泡劑比第一組略多，但也不影響實驗結果。

3.3 對實驗最后電泳中Marker少條帶的推測

3.3.1 通過與市售標準Marker電泳條帶圖對比后，確定是最小的一條條帶沒有跑出來，故其不在12%凝膠分離的最佳分離范圍（12-60KD）內。

3.3.2 Marker蛋白有問題。這個基本可以忽略，因是統(tǒng)一的Marker蛋白。

3.3.3 由于邊緣效應導致條帶跑歪，最后一條條帶與溴酚藍重合。可能性不大，因為制膠時都用了Loading Buffer，在空道上壓道。

3.4 體會

本次實驗得出的結論為研究目的基因與內含子Intein+CBD編碼基因的連接提供了一些參考，也給做類似實驗的同學在實驗過程中出現(xiàn)的相似情況提供一些幫助。實驗用數據證明了發(fā)酵罐比搖瓶更能良好地進行發(fā)酵，使我們對微生物發(fā)酵培養(yǎng)的基本步驟有了更深的印象。通過理論與實踐的結合，我們深入探究了大腸桿菌pTwin1-A質粒的誘導表達機理，對誘導表達的概念有了更直觀的認知，牢固掌握了外源蛋白的鑒定方法，為今后更深入的學習誘導表達奠定了基礎。

參考文獻

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作者簡介：顧天驕（1992，11-），男，籍貫：浙江省余姚市，學歷：本科，研究方向：生物工程。