巨噬細胞集落刺激因子對1，25二羥基膽鈣化醇誘導破骨樣細胞噬骨能力影響的觀察

摘要：目的 檢測M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）巨噬細胞集落刺激因子對1，25二羥基膽鈣化醇（1，25（OH）2D3）誘導形成的破骨樣細胞噬骨能力的影響。 方法 加入M-CSF及1，25二羥基膽鈣化醇（1，25（OH）2D3）誘導該大鼠骨髓單核細胞生成破骨樣細胞，對照組只加1，25二羥基膽鈣化醇誘導該大鼠骨髓單核細胞生成破骨樣細胞。用甲苯胺蘭染色鑒定破骨細胞嗜骨能力。 結果 誘導破骨細胞TRAP 染色陽性。甲苯胺蘭染色顯示破骨樣細胞在骨片上培養時產生一定面積及深度的骨陷凹。 結論M-CSF組形成的破骨樣細胞在特異酶及噬骨能力與對照組無差異。

關鍵詞：破骨細胞；培養；誘導；鑒定

中圖分類號：R816.8 文獻標識碼：A 文章編號：1005-0515（2013）8-023-02

材料和方法

1 動物及藥品

新生24 h Wistar大鼠（沈陽醫學院動物部）， 1， 25 （ OH ） 2 D3 、胰蛋白酶、 萘酚AS-BI磷酸鈉、酒石酸甲鈉（Sigma）， DMEM培養基（Gibco），胎牛血清（天津灝洋） ，EDTA，M-CSF（Sigma） 。

2 方法

2.1 薄骨磨片的制備及處理：

取新鮮成年牛股骨皮質-20℃貯存。使用前用鋼鋸鋸成1 cm寬條后用磨片機磨成厚50μm的 1 cm×1 cm骨片 ，蒸餾水中清洗 10次 ，置于75%酒精中，侵泡24 h，自然晾干 ，在超凈臺內骨片兩面紫外線照射消毒后放于DMEM 液中4℃備用。

2.2 M-CSF與1，25（OH）2D3誘導破骨樣細胞的生成：

出生24 h內的新生大鼠斷頸處死，無菌取其四肢長骨，在無菌PBS液中去凈附著在其表面的軟組織（盡可能去其所有組織）。將其骨干在DMEM培養基（含10%胎牛血清，4umol/L谷氨酰胺）中去除兩干骺端，然后縱行剖開，刮骨髓腔內表面直至骨干成為極為微小的碎片，用300目篩網濾過，用吸管反復多次輕吹洗篩網上殘渣，吸取濾過懸液置離心管內，4℃ 1000 r/min離心10 min，棄上清，加4 m1 DMEM培養液吹打均勻，接種于培養瓶中，37℃ CO2培養箱孵育20 h。輕吸取培養板中的培養液于離心管內，PBS液沖洗培養皿2遍，將洗滌下的液體也置于離心管內。0.05 %胰蛋白酶/0.02% EDTA聯合消化培養皿內的細胞5 min，將消化下的細胞也置入上述離心管內。PBS液沖洗培養皿2遍，DMEM終止胰蛋白酶的作用。倒置相差顯微鏡觀察，如殘留的單核細胞較多可重復所有上述操作。將上述收集于離心管內的細胞，在4℃ 1000 r/min下離心10 min，棄上清，加適量DMEM培養基，調整細胞密度約2x106/ml左右，將細胞接種于24孔板中，其中24孔板內置1x1cm2骨片，使細胞接種密度為2 x 106/cm2。使含1，25（OH）2D3組終濃度為10-8M[4]。分成M-CSF組和對照組，M-CSF組中加M-CSF使其終濃度為20ng/ml，置37 ℃ 5 % CO2培養箱內培養。隔日換液1次。

2.3 骨吸收陷窩定量分析

2.3.1 骨片吸收陷窩記數：

參考高建軍等方法[5]分別于3，6，9 d取出對照組和M-CSF組培養板中的骨片各四張，2.5%戊二醛固定7 min，與0.25mol/L氫氧化銨中超聲波清洗5 minX3次，系列梯度酒精脫水，自然涼干，1%甲苯胺藍染液室溫染色3～4min，蒸餾水清洗，于100倍光鏡下對整張骨片上的吸收陷窩記數。

2.3.2 吸收陷窩面積分析：

以上各組經甲苯胺藍染色骨片于400倍光鏡下隨機選取5個視野拍攝照片，采用計算機Meta Morph /Dp10 /Bx41分析系統勾畫出骨陷窩輪廓，計算并比較各組陷窩面積。

2.3.3 吸收陷窩深度分析：

以上各組經甲苯胺藍染色骨片于400倍光鏡下隨機選取5個視野拍攝照片，由于陷窩著色深淺與其深度有關，采用計算機MetaMorph/Dp10 /Bx41分析系統分析計算各組骨片上陷窩染色的平均光密度值，并以此比較各組陷窩深度的差異。

2.4 統計學處理

結果以ˉX ±s 表示，所有數據采用SPSS 1110 軟件進行，多組比較用one way ANOVA 方差分析，組間比較用q 檢驗；兩組比較用t 檢驗。P < 0.05 為差異有統計學意義。

結果

3.1吸收陷窩個數分析

從表3可以看出，隨著培養時間的延長，對照組與M-CSF組陷窩深度逐漸擴大，在3d、6d、9d時，對照組與M-CSF組之間經雙側t檢驗分析（p>0.05），說明兩組間吸收陷凹深度沒有差異。

討論

破骨細胞的分離培養見于80年代，1982年Chamber首次從乳兔四肢骨分離培養出成熟破骨細胞[1]，為骨吸收的體外研究奠定了基礎。我國于世風等[2 ]1988年率先引進了破骨細胞的培養方法并加以改良[3 ]。后來發現用1， 25 （ OH ） 2 D3誘導單核細胞形成破骨樣細胞。

大多數學者認為，破骨細胞屬單核/巨噬細胞譜系細胞，受多種基本調控的細胞因子的直接或間接刺激作用，經增殖、分化、生存與融合發育為多核的成熟破骨細胞，最后被活化[6]。最新的理論認為，在諸多調節破骨細胞分化和形成及其骨吸收的因素中，能直接作用于破骨細胞的只有一對既相互促進又相互制約的偶聯因子—破骨細胞分化因子（RANKL/ODF/OPGL/TRANCE）和破骨細胞形成抑制因子暨護骨素（OPG/OCIF）[7，8]。它們與破骨細胞膜上的RANK一道構成一個三因子系統。該系統在骨代謝的調節中具有極其重要的作用。調節破骨細胞分化、形成和吸收的眾多因子如PTH1α、1，25-（OH）2D3、IL等都是直接作用于成骨細胞，調節這兩個因子的濃度增加與減少，進而間接地完成它們的調節功能。

而1 ，25 （OH） 2D3 被證明是一種很強的骨吸收刺激因子，是維生素D 受體通路的代表因子，參與破骨細胞的形成及激活過程。目前國內所用的大鼠骨髓源性破骨細胞培養，主要以1 ，25 （OH） 2D3作為誘導物[5 ，6 ] 。由于骨髓干細胞1 ，25 （OH） 2D3 誘導培養體系需要成骨細胞支持，造成破骨細胞分離純化困難，所以這種方法比較適用于研究破骨細胞分化發育過程中細胞因子的調節作用，而不適合用于對細胞純度要求較高的破骨細胞分泌蛋白檢測、生化和分子生物研究。

巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）也稱為集落刺激因子-1（CSF-1），是一種具有譜系特異性的細胞因子。M-CSF為鏈間二硫鍵連接而成的二聚體糖蛋白，主要存在于骨髓腔內，對單核細胞的增殖、分化及維持其活性有重要作用。其受體為c-Fms。M-CSF是破骨細胞代謝過程中的關鍵因子，具有促進破骨細胞對骨吸收的作用。M-CSF對骨代謝的主要作用之一是上調破骨系統。HaynesDR等研究發現，在單核細胞和成骨細胞的體外共同培養系中，伴隨著破骨細胞的形成，出現M-CSF高表達；如果阻斷M-CSF與其受體的結合，可顯著減少破骨細胞的數目。M-CSF調節破骨細胞活性骨骼形成之后即處于不斷的成骨破骨的動態平衡中，破骨細胞的骨吸收活性維持并促進骨的更新與生長。成骨細胞合成和分泌的M-CSF不僅誘導破骨細胞的形成，對調節骨吸收活性也有重要作用。在小鼠骨髓/脾細胞和成骨/基質細胞體外共培養系統中，1，25（OH）2D3和Dex等鈣調節因子可激活成骨/基質細胞生成大量的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），后者作用于前破骨細胞，從而誘導這些細胞的增殖和分化。M-CSF已被證實是破骨細胞生成的必要條件。此外，Lacey DL等在實驗中還觀察到，經M-CSF誘導的骨髓培養細胞中可形成大量能被OPGL結合的細胞，這些細胞形態類似前破骨細胞，體外可經誘導形成具有吸收功能的成熟破骨細胞。

參考文獻：巨噬細胞集落刺激因子對破骨細胞生物作用的研究進展

醫藥科學綜合> 《現代醫學》> 2004年6月32卷3期>論著> 文章詳情 巨噬細胞集落刺激因子對破骨細胞生物作用的實驗研究

參考文獻：

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