托瑞米芬抗腫瘤作用機(jī)制及其在治療肺癌中的應(yīng)用分析

摘要：目的：主要對托瑞米芬的抗腫瘤作用機(jī)制以及其與順鉑的聯(lián)合應(yīng)用對癌細(xì)胞的治療效應(yīng)進(jìn)行研究，探索治療肺癌的新方向。方法：通過MTT的顯色法對托瑞米芬以及其與順鉑聯(lián)合之后在A549細(xì)胞上產(chǎn)生的毒性作用，將吸光度值測定出來。對DNA的含量用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，對p21蛋白表達(dá)的檢測運(yùn)用Western blot法。結(jié)果：托瑞米芬可以A549細(xì)胞的生長起到直接抑制的作用，5μmol/L以上的托米瑞芬可以將順鉑對細(xì)胞的毒性作用顯著增強(qiáng)[1]。運(yùn)用托瑞米芬可以明顯增強(qiáng)順鉑對于M期、G2期、以及S期細(xì)胞的作用，兩者聯(lián)合運(yùn)用之后可以增加p21蛋白表達(dá)。結(jié)論：5μmol/L以上的托米瑞芬和順鉑聯(lián)用在A549細(xì)胞上可以起到顯著協(xié)同的抗腫瘤的效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：托瑞米芬；抗腫瘤作用機(jī)制；肺癌；研究分析

中圖分類號：R563 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：C 文章編號：1005-0515（2013）8-120-02

順鉑是在肺癌治療中非常重要的一種化療藥物，然而因?yàn)樵诨熯^程中會形成耐藥性，就會較大限制順鉑的作用。我們通過運(yùn)用托瑞米芬與順鉑聯(lián)合作用對人體中的肺腺癌A549細(xì)胞生長產(chǎn)生的抑制作用的觀察，對其可能機(jī)制進(jìn)行明確，在綜合治療肺癌方面提供新的發(fā)展方向[2]。

1資料與方法

1.1運(yùn)用的材料和方法

1.1.1試劑和藥品 芬蘭的奧立安藥廠生產(chǎn)的托瑞米芬、昆明的三戍藥廠生產(chǎn)的順鉑，美國的Hyclone公司的RPMI-1640的培養(yǎng)基，華美公司的MTT，美國Sigma公司的胰蛋白酶和二甲基亞砜（DM-SO），美國的Callbiochem公司的p21wafl抗體，美國的Santa Cluz公司的抗鼠辣根過氧化物酶[3]，美國的PIERCE公司生產(chǎn)的T-PERTM的組織蛋白提取劑，美國的Bio-RAD公司生產(chǎn)的Micro-Plate Reader Model550型酶聯(lián)免疫的檢測儀，美國的Becton-Dickinson公司生產(chǎn)的Facscalibur型的流式細(xì)胞儀。

1.1.2細(xì)胞系的培養(yǎng) 人體的肺腺癌細(xì)胞是A549來自中國科學(xué)院的上海生物細(xì)胞研究所，在含有5%的二氧化碳，溫度為37攝氏度的溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，RPMI-1640作為培養(yǎng)液[4]。肺癌細(xì)胞是貼壁生長的，在兩到三天之后用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化和傳代。

1.1.3實(shí)驗(yàn)的分組 主要設(shè)置加入100μl培養(yǎng)基的空白組和加入100μl單細(xì)胞懸液的對照組以及加入處理因素和100μl單細(xì)胞懸液的實(shí)驗(yàn)組。其中實(shí)驗(yàn)組還分為聯(lián)合用藥組、化療藥物組、托瑞米芬組[5]。

1.2治療的方法 通過MTT的顯色法對托瑞米芬以及其與順鉑聯(lián)合之后在A549細(xì)胞上產(chǎn)生的毒性作用，將吸光度值測定出來。對DNA的含量用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。提取培養(yǎng)出來的細(xì)胞總蛋白，與Western blot的印記進(jìn)行雜交，對p21wafl蛋白表達(dá)的水平進(jìn)行檢測[6]。具體的操作步驟為：在六孔板中把A549的細(xì)胞株進(jìn)行接種，RPMI-1640作為培養(yǎng)液，在其中分別加入順鉑、托瑞米芬和兩者的結(jié)合物，將空白的對照設(shè)置出來，在經(jīng)過二十四小時(shí)的培養(yǎng)之后將培養(yǎng)液倒掉，用PBS液沖洗三次，在其中加入T-PERTM的組織蛋白提取劑，對細(xì)胞進(jìn)行溶解和裂解，將蛋白提取出來。在沸水中把樣品加熱十分鐘，用每分鐘10000r進(jìn)行十分鐘離心，對上清進(jìn)行吸取。進(jìn)行SDS的凝膠電泳，通過電轉(zhuǎn)移的方法把蛋白移至硝酸纖維的素膜上，在運(yùn)用50g/L的脫脂奶粉封閉之后再在其中加入p21wafl的單克隆抗體，兩個(gè)小時(shí)之后，運(yùn)用PBS液沖洗三次，再將二抗加入，兩個(gè)半小時(shí)之后，再將化學(xué)發(fā)光劑加入，將暗盒放入、壓片，十分鐘之后，顯影、定影[7]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)的處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，p<0.05說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

托瑞米芬對于A549的細(xì)胞生長產(chǎn)生了一定的抑制作用，如表一所示，5μmol/L以上的托米瑞芬可以將順鉑對細(xì)胞的毒性作用顯著增強(qiáng)，存在的差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。運(yùn)用托瑞米芬可以明顯增強(qiáng)順鉑對于M期、G2期、以及S期細(xì)胞的作用，兩者聯(lián)合運(yùn)用之后可以增加p21蛋白表達(dá)。具體的情況見表一、表二。

3討論

通過研究表明，在單獨(dú)運(yùn)用托瑞米芬的時(shí)候可以對A549細(xì)胞的生長起到一定的抑制作用，抑制的作用會隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。然而如果僅僅靠藥物的劑量并不能達(dá)到將抑制的效應(yīng)提高到理想的效果，有時(shí)還會適得其反，會有一些毒副作用產(chǎn)生[8]。托瑞米芬與順鉑聯(lián)合所產(chǎn)生的協(xié)同作用是非常顯著的，盡管各自的藥量都降低了，但是其對癌細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性作用依然大于這兩種藥物單獨(dú)使用。根據(jù)目前的研究的情況來看，托瑞米芬在對癌細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用和與化療藥物協(xié)同的作用機(jī)制還不是非常明顯。根據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測不難發(fā)現(xiàn)，托瑞米芬與順鉑聯(lián)合之后，細(xì)胞周期阻斷的時(shí)期產(chǎn)生變化了，G2和S期的比例下降了[9]，G1期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)受到了阻滯，這就說明了托瑞米芬在癌細(xì)胞的DNA合成以及合成后期和有絲分裂期的作用，會阻斷整個(gè)繁殖的周期，對細(xì)胞的生長起到一定的抑制作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]李大鵬，張磊，李艷.托瑞米芬抗腫瘤作用機(jī)制及肺癌治療中的應(yīng)用[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，12（3）：12-13.

[2]劉利則，夏莉，劉玉俠，段北野.托瑞米芬逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP耐藥性的研究[J].中國免疫學(xué)雜志，2012，28（12）：1078-1081.

[3]周易冬，沈松杰，孫強(qiáng)，關(guān)競紅，茅楓.托瑞米芬治療絕經(jīng)前婦女周期性乳痛癥的安全性和有效性臨床研究[J].中華乳腺病雜志（電子版），2012，6（5）：29-32.

[4]李大鵬，張磊，趙東海.托瑞米芬聯(lián)合長春瑞濱對兔VX2腫瘤模型影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（10）：29-31.

[5]孟芹，丁兆軍，遲玉華，周彩存，粟波.托瑞米芬聯(lián)合順鉑對p53缺失型肺癌細(xì)胞株H1299生長抑制作用的研究[J].中國醫(yī)藥，2012，7（8）：947-949.

[6]林平，傅曉欽，錢飛中，劉文涵.頂空氣相色譜法測定枸櫞酸托瑞米芬原料藥中溶劑殘留量[J].中國藥房，2011，22（1）：47-49.

[7]安東建，柴琴，田垣，蘇天海，湯效，謝熠.大劑量托瑞米芬逆轉(zhuǎn)肺癌多藥耐藥及化療增敏的臨床研究[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2009，10（1）：36-38.

[8]安東建，柴琴，田垣，蘇天海，湯效，謝熠.大劑量托瑞米芬加NP方案治療48例非小細(xì)胞肺癌的毒性反應(yīng)觀察[J].中國腫瘤，2009，18（7）：587-588.

[9]魯冰，倪健，周彩存.托瑞米芬聯(lián)合長春瑞濱和順鉑二線治療中晚期非小細(xì)胞肺癌的療效[J].腫瘤，2010，15（2）：148-151.