番茄紅素抑制人腦膠質瘤U251細胞生長的實驗研究

[摘要] 目的 探討番茄紅素對體外培養的人腦膠質瘤U251細胞增殖及誘導凋亡的作用。 方法 用CCK-8 法檢測不同濃度番茄紅素作用于U251細胞24 h、48 h 及72 h后細胞的存活率；應用流式細胞術（FCM）檢測細胞周期。 結果 番茄紅素能抑制人腦膠質瘤U251細胞的生長，呈量-效及時-效關系（P<0.01）；FCM 檢測表明，細胞主要被阻滯在G0/G1期；番茄紅素誘導細胞凋亡率較對照組明顯增加（P<0.01），具有濃度依賴性。 結論 番茄紅素能抑制U251 細胞增殖，誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] 番茄紅素；神經膠質瘤；細胞凋亡

[中圖分類號] R730.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）27-0003-02

番茄紅素是番茄等植物中含有的一種具有抗癌活性的烴類類胡蘿卜素A，研究發現，番茄紅素通過抗氧化、清除組織自由基及調控癌細胞增殖等作用促進多種腫瘤細胞的凋亡。本研究旨在從細胞凋亡方面探討番茄紅素對膠質瘤U251細胞生長的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人腦膠質瘤細胞株U251（購于武漢博士德生物工程有限公司），番茄紅素（購自成都格雷西亞化學技術有限公司），四氫呋喃（THF，稀釋番茄紅素用），細胞增殖檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（購自武漢博士德生物工程有限公司），流式細胞儀（FCM，美國BD公司），酶聯免疫儀（中科院生產）。

1.2 細胞培養

將U251細胞接種于DMEM培養液中（含有100 U/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、0.2%NaHCO3及10%胎牛血清），放在5%CO2、37℃孵箱中進行培養。

1.3 檢測番茄紅素對細胞增殖的作用（CCK-8法）

將濃度為1×104個/mL的對數期U251 細胞接種至96孔板內。本實驗按時間長短（24 h、48 h、72 h）分三組，每組再分為不同濃度（0.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）的番茄紅素處理組及只有稀釋溶劑THF的空白對照組，每組設立5個重復孔加強實驗準確性。各組細胞經過一段時間的培養（細胞相對穩定）后更換為對應濃度番茄紅素的培養液，再經不同時間（24 h、48 h及72 h）培養后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液后孵育1 h，觀察各組細胞的生長狀態，用酶標儀檢測其在450 nm波長時的光密度值 。

1.4 檢測細胞周期

培養48 h后，收集不同濃度（0.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L）的番茄紅素處理組及稀釋溶劑THF空白對照組，調整細胞濃度至1×105個/mL，分別取5 mL實驗樣本進行相關處理后，FCM檢測各組U251腫瘤的細胞周期分布。

1.5 統計學分析

應用SPSS13.0軟件處理實驗所得數據。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。不同實驗組間采用單因素方差分析等統計學方法，并用t檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 番茄紅素對人腦膠質瘤細胞存活率的影響

番茄紅素對人腦膠質瘤U251細胞的抑制作用：檢測各實驗組細胞的存活率（使用CCK-8法），當前存活率即同一濃度處理組OD 值均值與對照組OD 值均值的比值乘以100%（設對照組存活率為100%）。實驗證明：不同濃度與不同的作用時間沒有交互作用（F=0.54，P>0.05）；相同濃度的番茄紅素隨著時間的延長，對細胞的抑制作用增強，在作用時間一定的情況下，隨著作用濃度的增大，抑制作用也隨之增強，即番茄紅素對U251 細胞的作用有時間依賴性（F=509.32，P<0.01）和濃度依賴性（F=58.60，P<0.01）；隨著番茄紅素作用濃度的增加和作用時間的延長，細胞抑制作用都逐漸加強。見表1。

2.2 番茄紅素對人腦膠質瘤細胞增殖指數及S期比例的影響

FCM 檢測細胞周期和細胞凋亡結果：各不同濃度番茄紅素和THF對照組細胞分別作用48 h后，測得的細胞周期，各組G0+G1、S、G2+M 期細胞所占比例。在作用時間一定的情況下，G0+G1期比例升高，S期及（G2+M）期比例降低。在作用時間相同的條件下，增殖指數（PI）及S期比例（S Phase Fraction，SPF）隨著各組細胞培養液作用濃度的增加都有所下降。見表2。

3 討論

許多研究表明，蔬菜及水果對預防及治療人類的癌癥具有積極而有效的作用。近年來發現番茄紅素是眾多蔬菜及水果提取物質中的一種有效的防癌成分[1]。番茄紅素是類胡蘿卜素中的一種，近些年的研究發現，番茄紅素作為類胡蘿卜素中最強力的抗氧化劑。番茄紅素可以穿過血腦屏障[2]，對膠質瘤有潛在的促進凋亡和抑制侵襲作用，其防癌抗癌作用日益受到重視。國外研究人員對72項相關研究進行科學的分析，其中57項研究證明患某些類型癌癥的風險和攝入番茄的劑量及番茄紅素的血液水平呈負相關，其中有明顯統計學意義的有35項，而且沒有一項研究中發現番茄紅素可以加大患者發生癌癥的風險[3-5]。近年來，陸續有大量實驗研究證明番茄紅素對前列腺癌、消化道癌癥和肺癌等多種癌癥具有很明顯的預防及治療作用。相關實驗還證明患有宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌和消化道癌的概率及該病的死亡率同人體番茄紅素的攝入量及血液濃度成反比[6-8]。番茄紅素抑制癌細胞的體外研究已有很多報道[9-11]。番茄紅素對多種腫瘤的預防及治療表現出較好效果，相關實驗已經研究證實番茄紅素可在不傷及正常細胞的前提下誘導前列腺癌等多種腫瘤細胞的凋亡，但其對腦膠質瘤作用方面的相關研究較少。本實驗研究旨在使用流式細胞術檢測凋亡來證實番茄紅素可以通過誘導人腦膠質瘤U251細胞凋亡來抑制其生長，這種表現與番茄紅素作用于其他腫瘤細胞并發生凋亡的結果基本相同，均表現為明顯的濃度依賴性，作用濃度越高，其凋亡率越高。至于番茄紅素作用于U251細胞的具體機制則需要更深一步的探討。本實驗研究證明，番茄紅素對人腦膠質瘤U251細胞的生長抑制作用呈濃度依賴性及時間依賴性，表明番茄紅素在體外對U251細胞具有抗腫瘤活性的作用。

實驗所得細胞周期的結果（流式細胞儀檢測）：番茄紅素作用后U251細胞后，G0/G1期細胞所占比重隨著濃度的加大而增大，而S期細胞的比重則有所下降，表明番茄紅素抑制腫瘤細胞增殖可能與阻滯細胞在G0/G1期，而進入S期的有所減少有關。有相關研究已經證實番茄紅素可以調節細胞周期并能縮小人前列腺癌病灶的大小，也有實驗表明番茄紅素可通過影響乳腺癌、肺癌和子宮癌等細胞由G0/G1期向S期的轉化來影響抑制腫瘤細胞的生長[12]。唐莉莉等[13]通過對前列腺癌DU145細胞的實驗發現番茄紅素對DU145抑制率高達78%，并呈現明顯的劑量-效應關系；番茄紅素可影響前列腺癌DU145細胞周期同時誘發其凋亡。

本實驗研究證明番茄紅素對體外培養的人腦膠質瘤U251 細胞增殖有抑制作用并引發其凋亡，但目前對番茄紅素的抗腫瘤的相關性研究較少，進一步的研究將深入探討番茄紅素對人腦膠質瘤的影響機制，并為番茄紅素臨床治療膠質瘤提供理論依據。

[參考文獻]

[1] Burgess LC，Rice E，Fischer T，et al. Lycopene has limited effect on cell proliferation in only two of seven human cell lines（both cancerous and noncancerous） in an in vitro system with doses across the physiological range[J]. Toxicology in Vitro，2008，22（5）：1297-1300.

[2] 李曉，羅晨禹，楊拯，等. 番茄紅素抗氧化應激效應對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響[J]. 中國康復理論與實踐，2013，19（2）：132-135.

[3] Dragan Ilic，Marie Misso. Lycopene for the prevention and treatment of benign prostatic hyperplasia and prostate cancer：A systematic review[J]. Maturitas，2012，72（4）：269-276.

[4] Cong Luo，XianGuo Wu. Lycopene Enhances Antioxidant Enzyme Activities and Immunity Function in N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine-Induced Gastric Cancer Rats[J]. International Journal of Molecular Sciences，2011，12（5）：3340-3351.

[5] Dorien W，Johannes M. G. Doorn，Hester S. A. Oldenburg，Nicola S. Russell，Rutgers，Flora E. Laura J. Effects of Lycopene on the Insulin-Like Growth Factor （IGF） System in Premenopausal Breast Cancer Survivors and Women at High Familial Breast Cancer Risk[J]. Nutrition and Cancer，2008，60（3）：342-353.

[6] Kristal Alan R，Till Cathee，Platz Elizabeth A，et al. Serum lycopene concentration and prostate cancer risk：results from the Prostate Cancer Prevention Trial[J]. Cancer epidemiology，biomarkers prevention：a publication of the American Association for Cancer Research， cosponsored by the American Society of Preventive Oncology，2011， 20（4）：638-646.

[7] 劉玲，蔣卓勤. 番茄紅素生物活性與慢性病關系的研究進展[J]. 國外醫學：衛生學分冊，2008，35（1）：48-51.

[8] 黃萍，唐大寒. 番茄紅素與腫瘤及心血管疾病的研究進展[J]. 實用預防醫學，2009，10（16）：1672-1674.

[9] 趙其輝，邱青朝，胡波. 番茄紅素誘導人結腸癌SW480細胞凋亡的作用機制[J]. 腫瘤防治研究，2012，39（11）：1306-1310.

[10] 肖白曼，陳文華，劉培培，等. 番茄紅素對小鼠前胃癌的保護作用[J].中國衛生檢驗雜志，2012，22（10）：2344-2346.

[11] Feng Yao Tang，Man Hui Pai，Xiang Dong Wang. Concomitant consumption of lycopene and fish oil inhibits tumor growth and progression in a mouse xenograft model of colon cancer[J]. Mol. Nutr Food Res，2012，56（10）：1520-1531.

[12] Teodoro Anderson Junger，Oliveira Felipe Leite，et al. Effect of lycopene on cell viability and cell cycle progression in human cancer cell lines[J]. Cancer cell international，2012，12（1）：36.

[13] 唐莉莉，曾祥斌，金泰. 番茄紅素對人前列腺癌細胞生長的影響[J].中國公共衛生，2001，17（2）：118-119.

（收稿日期：2013-07-02）