補腎化痰祛瘀法對血管性癡呆大鼠認知功能的保護作用

[摘要] 目的 研究補腎化痰祛瘀方對血管性癡呆（VaD）大鼠認知功能的改善作用。 方法 在缺糖缺氧培養條件下，觀察補腎化痰祛瘀方血清對體外培養的海馬神經元的保護作用。用雙側頸總動脈永久性結扎法（2VO）制備VaD大鼠模型，造模前予灌胃治療，Morris水迷宮測試治療后VaD大鼠認知功能的改善情況，TUNEL染色測定各組大鼠海馬腦組織內細胞凋亡的變化。免疫組織化學方法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達。 結果 在缺糖缺氧培養條件下，體外培養海馬神經元出現大量的細胞凋亡，而預先加入補腎化痰祛瘀方的血清進行處理后，細胞凋亡率明顯下降。補腎化痰祛瘀方灌胃治療的VaD大鼠，與未予治療的VaD大鼠組相比，治療組大鼠找到平臺的潛伏期縮短（P < 0.01），穿越平臺次數增多（P < 0.01）；與癡呆組相比，補腎化痰祛瘀方治療組大鼠腦組織海馬區凋亡細胞數明顯減少，抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著增加，凋亡基因Bax蛋白表達降低，差異有統計學意義（P < 0.01）。 結論 補腎化痰祛瘀方對大鼠體外培養和腦組織內海馬神經元具有神經保護作用，補腎化痰祛瘀方治療可以明顯改善VaD大鼠的認知功能。

[關鍵詞] 補腎化痰祛瘀方；血管性癡呆；認知功能；細胞凋亡

[中圖分類號] R277.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）31-0001-03

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血

[基金項目] 廣東省廣州市中醫藥、中西醫結合科研課題（2009A25）；廣東省中醫藥局科研立項（2010020）；廣東省醫學科研基金立項（A201 3506）；廣東省廣州市衛生局一般引導項目（20131A011047）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是由一系列腦血管因素（缺血或出血或急慢性缺氧性腦血管病等）導致腦組織損害，引起以認知功能障礙為特征的綜合征[1，2]。血管性癡呆屬于中醫學“呆病”范疇，其病位在腦，其本在于心肝脾腎的功能失調；其標在于痰濁癖血，蒙閉清竅，致神機失用。補腎化痰祛瘀方具有補腎填精，益髓充腦，使腦髓得充，氣血得益，兼化癖濁，開腦竅的作用[3，4]。本研究采用補腎化痰祛瘀方腦內注射治療VaD模型大鼠，觀察其對VaD大鼠認知功能的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 出生后第1天SD大鼠4只；老齡健康雄性SD大鼠65只，月齡>16個月，體重300～450 g，由中山大學北校區實驗動物中心提供。

1.1.2 藥物 補腎化痰祛瘀方為熟地、山茱萸、枸杞子、制首烏、菟絲子、桃仁、紅花、當歸、川芎、丹參、制半夏、炙遠志、石菖蒲、膽南星、枳實等組成，經水煎制成濃縮液，高、低劑量組分別相當于含生藥2 g/mL和1 g/mL。

1.1.3 試劑 Neurobasal A（Gibco），B27（Gibco），胎牛血清（Sigma），胰蛋白酶（Gibco），多聚賴氨酸（Sigma），阿糖胞苷（上海華聯制藥有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 補腎化痰祛瘀方對體外培養海馬神經元的保護作用 （1）海馬神經元的培養 取出生1 d的SD大鼠，在無菌條件下分離出雙側海馬，充分剪碎，加入0.125%胰蛋白酶，在37℃水浴中溫育30 min，10%胎牛血清終止消化，小心地吸除胰蛋白酶液，加入5 mL PBS，輕柔地震動混勻，靜置5 min；吸除上清，加入5 mL PBS，用吸管吹打分散組織制成細胞懸液，用臺盼蘭染色以了解細胞活性；按1 000/cm2的密度接種于有多聚賴氨酸包被的培養瓶中，加入含10%胎牛血清的Neurobasal A+B27的培養基5 mL，于37℃含5%CO2的培養箱中培養。培養24 h后用Neurobasal A+B27無血清培養基全量換液，以后每周換液2次，每次更換一半新鮮培養液。在神經元接種3 d后加入終濃度為3 mg/L的阿糖胞苷，以抑制神經膠質細胞的增殖[5]。（2）補腎化痰祛瘀方藥物血清和空白血清的收集 SD大鼠灌胃給予補腎化痰祛瘀方的濃縮液，相當于生藥量為25 g/kg，2次/d，給藥7 d，末次給藥2 h后，無菌條件下，心室內取血，分離血清，56℃補體滅活，-80℃凍存備用。用于實驗時，用完全培養基分別稀釋成5%、10%、20%三種不同濃度的含藥血清。空白血清的獲得是予SD大鼠灌服0.9%生理鹽水連續7 d，給藥時間、方法和獲取血清方法同補腎化痰祛瘀方。（3）缺氧缺糖試驗 取培養12 d的海馬神經元，按實驗分為對照組、空白血清組和補腎化痰祛瘀方組，在缺糖缺氧前24 h，按如下方案給藥：①培養基組，②空白血清組，③5%含藥血清組，④10%含藥血清組，⑤20%含藥血清組，更換無糖平衡鹽緩沖液（116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1.1 mmol/L NaH2PO4，26.2 mmol/L NaHCO3， 1.8 mmol/L CaCl2）。然后將各組細胞同時移至恒溫（37℃）密閉容器內，連續充以無氧氣體（90%N2、10%CO2），在缺糖缺氧條件下分別培養1 h、4 h、12 h后，進行細胞凋亡分析。（4）細胞凋亡分析 將上述在缺糖缺氧環境下培養的細胞，先經4%多聚甲醛固定30 min后，然后采用甩片法將細胞貼壁在玻片上，加入TUNEL反應試劑，在顯微鏡下觀察并計數相鄰視野TUNEL陽性染色及陰性染色神經元數目，計算細胞凋亡率。

1.2.2 血管性癡呆大鼠模型的建立及分組處理 將雄性SD大鼠用10%水合氯醛（0.035 mL/10 g）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈，并以4號絲線阻斷血流20 min，可以觀察到大鼠驚厥、呼吸深慢、心跳加快；同時在距鼠尾尖約1 cm處斷尾，放血約0.3 mL。松開絲線扣恢復血流10 min后，再次阻斷血流20 min，如此重復3次，第3次血流再灌注后觀察30 min，如大鼠呼吸、心跳平穩，即可縫合皮膚，放回籠中正常飼養。其中假手術組僅分離雙側頸總動脈，套絲扣；但不阻斷血流，尾部不放血，觀察時間、飼養條件與模型組相同。造模前大鼠隨機分成6組，每組10只：正常組，假手術組，模型組，尼莫地平組，補腎化痰祛瘀方低劑量組，補腎化痰祛瘀方高劑量組。補腎化痰祛瘀方低、高劑量組分別給大鼠灌胃該藥水煎液，相當于生藥量10.0 g/（kg·d）和20.0 g/（kg·d），正常組、假手術組、模型組均給予等容積的生理鹽水灌胃；而尼莫地平組灌胃用尼莫地平混懸液10 mg/（kg·d），手術當天提前2 h灌胃，直至術后15 d。在灌胃后30 d，分別對上述各組大鼠進行水迷宮試驗，觀察各組大鼠學習和記憶成績。

1.2.3 Morris水迷宮測試 （1）定位航行試驗 水溫控制在25℃左右，每日上下午各4次，將大鼠面向池壁分四個象限放入水中，記錄其在2 min內尋找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果大鼠在2 min內未找到平臺，則用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留20 s，再放回籠中，其潛伏期算120 s。歷時5 d。（2）空間探索試驗 第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入，記錄其2 min內跨越原平臺位置的次數。

1.2.4 免疫組織化學檢測Bcl-2、Bax陽性細胞的表達 各組大鼠在行為測試完畢后以10%水合氯醛麻醉，立即開胸暴露心臟，左心室迅速插管至主動脈，同時剪開右心耳，灌注生理鹽水100 mL，再灌注4%的多聚甲醛250 mL，速度先快后慢，至頸部非常僵硬為滿意，迅速取腦并分離左側海馬區組織，4%多聚甲醛中浸置4～6 h，經乙醇常規脫水、二甲苯透明后，浸蠟包埋，5 μm厚切片，行免疫組化染色，嚴格按照說明操作。

1.3 統計學處理

應用SPSS統計學軟件，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，方差齊性檢驗以a=0.1為檢驗水準。組間比較應用單因素方差分析，各實驗組間的兩兩比較采用q檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL法檢測細胞凋亡率

TUNEL陽性染色光學顯微鏡下細胞胞核呈棕黃色，缺氧缺糖后，隨著缺氧缺糖時間的延長凋亡細胞逐漸增多。凋亡的神經元表面皺縮，體積縮小，細胞核固縮，有時可見碎裂成數個圓形顆粒的凋亡小體。培養基組和空白血清組之間無明顯差異（P > 0.05）。經補腎化痰祛瘀方預處理的海馬神經元細胞凋亡數目明顯減少，凋亡神經細胞發生率與培養基組、空白血清組比均有顯著性差異（P < 0.05），且與含藥血清濃度具有相關性。在三種不同濃度的含藥血清組間，20%含藥血清細胞凋亡率最低。見表1。

2.2 Morris水迷宮實驗結果

模型組所用逃避潛伏期時間明顯長于空白組、尼莫地平組、補腎化痰祛瘀方高劑量組及低劑量組，均有顯著差異（P < 0.01）。補腎化痰祛瘀方高劑量組逃避潛伏期時間較尼莫地平組減少，差異有統計學意義?？臻g探索試驗結果顯示，補腎化痰祛瘀方高劑量組、低劑量組、尼莫地平組跨越平臺次數均高于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。補腎化痰祛瘀方高劑量組逃避潛伏期時間、跨越平臺次數高于尼莫地平組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1區Bax，Bcl-2蛋白的表達

與假手術組比較，模型組凋亡基因Bax蛋白表達顯著增加（P < 0.01），抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著下降（P < 0.01）。與模型組比較，尼莫地平組、補腎化痰祛瘀方低劑量組、補腎化痰祛瘀方高劑量組抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達顯著增加（P < 0.01），凋亡基因Bax蛋白表達降低（P < 0.01）。說明補腎化痰祛瘀方可能通過影響凋亡相關蛋白的表達而發揮神經保護作用。補腎化痰祛瘀方高劑量組與尼莫地平組相比，Bcl-2蛋白表達增加，Bax蛋白表達下降，差異有統計學意義（P < 0.01）。見表3。

3 討論

中醫認為，血管性癡呆是在精氣虧虛的前提下產生瘀血、痰濁后形成的本虛標實、虛實夾雜證，補腎化痰祛瘀法補腎填精治其本，化痰祛瘀治其標，標本兼顧，故對血管性癡呆有防治作用。補腎化痰祛瘀方是在醒腦益智方和加味溫膽湯的基礎上化裁而來，方中的枸杞子具有增強造血功能、降脂、調節免疫、延緩衰老等作用，制首烏、菟絲子可增加腦組織SOD活性，山萸肉滋補肝腎，桃仁、紅花、當歸活血祛瘀，菖蒲化痰開竅，共奏補腎固本、化痰祛瘀開竅之功。全方配伍，具有補腎填精，益髓充腦，使腦髓得充，氣血得益，兼化癖濁，開腦竅的作用，從而達到治療VaD的目的。在本實驗中，我們采用補腎化痰祛瘀方對血管性癡呆大鼠進行治療，可明顯改善大鼠搜索平臺的潛伏期和跨越平臺的次數，改善大鼠學習記憶功能。

短暫性腦缺血或缺血后再灌注后引起的海馬CA1區遲發性神經元死亡（DND），是VaD常見的發生機制之一，CA1區神經元的凋亡損傷可能是腦血管病后發生VaD的病理基礎，海馬神經元的凋亡丟失和缺血壞死影響了神經元突觸的可塑性，影響了海馬對信息的處理和傳遞，引起腦缺血后記憶認知功能損害[6-9]。近年研究表明，中藥不僅可以保護神經細胞，提高神經元抵抗損傷的能力，并對CNS神經再生及神經功能重建具有促進作用。本實驗中，在缺糖缺氧培養條件下體外培養的海馬神經元出現大量的細胞凋亡，而預先加入補腎化痰祛瘀方血清進行處理后，細胞凋亡率明顯下降，說明補腎化痰祛瘀方對缺糖缺氧培養條件誘導的海馬神經元凋亡有拮抗作用，因此具有神經保護作用，提高抵抗神經元損傷能力。

近來的體外研究及動物實驗研究顯示：Bcl-2保護細胞免于各種損傷，包括興奮性氨基酸毒性、Ca增多、脂質過氧化、自由基損傷等。Bcl-2表達的增加對腦缺血后損傷具有保護作用。Bax蛋白是促進細胞凋亡因子。促凋亡Bax蛋白在局灶和全腦缺血中對注定死亡的神經元出現表達增多的現象，而在缺血損傷后恢復的神經元中的表達穩定。在我們的動物實驗中，VaD模型組大鼠CA1區Bax高表達，Bcl-2低表達，凋亡細胞增多，證實了長期低灌注可使海馬神經元凋亡，影響認知和記憶。補腎化痰祛瘀方低劑量組和高劑量組與模型組相比，均有Bcl-2的高表達、Bax的低表達，凋亡細胞也明顯減少。說明補腎化痰祛瘀方能抑制海馬神經元細胞的凋亡，達到保護神經元、改善VaD大鼠學習記憶能力的效果，其機制與調節凋亡相關蛋白的表達相關。

總之，補腎化痰祛瘀方在拮抗VaD大鼠海馬CA1區神經元凋亡，與其在行為學上改善VaD大鼠學習記憶能力一致。由此我們可以推斷補腎化痰祛瘀方可以通過促進Bcl-2的表達，減少Bax的表達，抑制海馬神經元細胞的凋亡，從而改善VaD大鼠學習記憶能力，兩者是相輔相成，互為因果。下一步的實驗中我們將進一步研究補腎化痰祛瘀方保護神經元的分子機制。

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（收稿日期：2013-08-29）