HPLC—ELSD測定黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量

[摘要]目的 建立測定黃芪破壁飲片中黃芪甲苷含量的高效液相-蒸發光散射檢測的方法。方法 采用C18柱（5 μm，200 mm×4.6 mm）， 乙腈-水（32∶68）為流動相，流速1.0 mL/min，蒸發光散射檢測器漂移管溫度80℃，載氣流速2.7 mL/min。 結果 該方法回收率99.5%（RSD=2.0%），精密度RSD=1.4%，重復性RSD=2.5%，黃芪甲苷在（1.2913～10.330）μg范圍內線性關系良好（r = 0.9998）。 結論 該方法簡便快速，可作為黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量測定方法。

[關鍵詞] 黃芪破壁飲片；黃芪甲苷；HPLC-ELSD；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）17-0095-02

黃芪是一味常用中藥材，具有補氣升陽、固表止汗、生津養血之功效，用于氣虛乏力、食少便溏、氣虛水腫等病癥。黃芪破壁飲片是一種新型飲片，采用現代超微粉碎技術，將黃芪飲片粉碎成細胞破壁粉體，再經制粒加工成均勻一致的原飲片全成分的均勻干燥顆粒狀飲片。本實驗比較了不同提取方法對含量測定結果的影響，結果表明本方法可作為黃芪破壁飲片中黃芪甲苷的含量測定方法。

1儀器與試藥

儀器： Agilent 1100高效液相色譜儀；檢測器：Alltech 蒸發光散射檢測器；色譜柱：Ecosil C18（5 μm，200 mm×4.6 mm）、Dikma Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×200 mm）、Wondasil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。天平：Precisa XT200A電子天平、Sartorius LA230S電子天平、Sartorius ME235S 電子天平。

試劑：甲醇、氫氧化鉀、乙醇、正丁醇、氫氧化鈉、氨水等均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

黃芪破壁飲片（中山中智中藥飲片有限公司，090401等10批）；黃芪甲苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200613）。

2方法與結果

2.1色譜條件與系統適應性試驗

2.1.1流動相的選擇 參考《中國藥典》2010版一部“黃芪”含量測定項下的流動相，以乙腈-水（32∶68）為流動相，等度洗脫。

2.1.2色譜柱的選擇 曾試用Ecosil C18、Merck C18、Thermo ODS Hypersil C18等多種品牌的色譜柱，結果各色譜柱所得待測成分色譜峰峰形好，分離理想。本試驗采用Ecosil C18色譜柱。

2.1.3提取方法的選擇 提取方法一：取本品約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水10 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，柱高12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[1]。提取方法二：取本品約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，并用甲醇補足重量，濾過，精密量取續濾液25 mL，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇液，用1%氫氧化鈉溶液充分洗滌2次，每次30 mL，棄去堿液，正丁醇液用水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[2]。提取方法三：取本品約1g，精密稱定，置錐形瓶中，加入2%氫氧化鉀甲醇溶液50 mL，加熱回流2 h，放冷，過濾，用少量甲醇洗滌濾渣及容器，合并洗滌液與濾液，蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，置于分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水30 mL洗滌，棄去水層，正丁醇液蒸干，用甲醇溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。提取方法四：取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL， 1%氫氧化鈉溶液5 mL，加熱回流2 h，濾過，濾渣用甲醇適量洗滌，合并濾液減壓回收至干， 殘渣用甲醇溶解并轉移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得[3]。

在試驗中選用不同的提取方法進行比較，結果表明方法三中黃芪甲苷的峰面積最高，且方法較簡便，故供試品溶液的制備方法選擇方法三作為提取方法[4]。比較結果見表1。

3方法學驗證

3.1加樣回收試驗

黃芪甲苷對照品回收溶液的制備：精密稱定黃芪甲苷對照品（中檢所，批號110781～200613）0.01578 g，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為黃芪甲苷對照品溶液（0.6312 mg/mL）。

供試品溶液的制備：取已知含量的黃芪破壁飲片（批號090401）6份，每份0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，分別精密加入黃芪甲苷對照品溶液2.5 mL，按供試品溶液制備方法制備。見表2。

3.2精密度試驗

3.2.1儀器精密度試驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液，在相同的色譜條件下連續進樣6次，測定黃芪甲苷峰面積，結果RSD%為1.4%，儀器精密度良好。

3.2.2重復性試驗 取同一批黃芪破壁飲片（090401），取6份，每份1 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，測定結果見表3。

3.3線性關系

分別精密吸取0.5165 mg/mL的黃芪甲苷對照品溶液2.5 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，注入液相色譜儀中，所得線性關系數據（表4）以對照品濃度（μg）的自然對數為橫坐標（X），峰面積的自然對數為縱坐標（Y）繪圖得直線，回歸方程為Y = 1.71212X +6.72130，r = 0.99987，表明黃芪甲苷進樣量在（1.2913 ～10.3300）μg范圍內呈良好的線性關系。

3.4耐用性考察

3.4.1被測溶液的穩定性 取同一份供試品溶液（090401），分別在0、6、18、24 h注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，結果表明被測溶液在24 h內穩定，見表5。

3.4.2不同色譜柱的考察 取同一批供試品溶液（090401），采用三條不同牌子的色譜柱進行測定，考察本品在使用不同牌子C18色譜柱時，黃芪甲苷含量測定結果不受結果影響的程度，結果見表6。

3.4.3不同儀器的考察 取同一批供試品溶液（090401），采用不同牌子儀器進行測定，考察本品在使用不同牌子儀器時，黃芪甲苷含量測定結果不受結果影響的程度，結果見表7。

4含量測定

5討論

破壁飲片作為一種新型飲片受到越來越多的關注，它克服了傳統中藥飲片粗、大且需煎煮等諸多缺陷，具有質量均勻度高、衛生學標準高、穩定性好、形態美觀、應用方便靈活等優點。該新型飲片進入市場以來獲得良好的經濟效益，今后有望進入醫院藥房補充部分傳統飲片的不足。

黃芪飲片經超微粉碎破壁后，外觀形態發生改變，但飲片本身未發生質的改變，其含量測定結果未發現明顯變化。

本實驗比較了四種提取方法對測定結果的影響，簡化了2010版中國藥典現行的黃芪藥材供試品處理方法。

由于飲片破壁后比表面積增加，理論上黃芪破壁飲片的有效成分較普通飲片溶出速度快，該部分實驗有待后續完成。

[參考文獻]

[1] 許峰，高華宏. 高效液相色譜-蒸發光散射檢測法測定健天顆粒中黃芪甲苷含量[J]. 中國藥業，2011，20（5）：21.

[2] 彭乃煥，陶窕平，馮紹帆. HPLC-ELSD法測定健脾靈糖漿中黃芪甲苷含量[J]. 中國醫藥指南，2011，24（9）：232.

[3] 張春輝，吳愛英，楊曉云. HPLC-ELSD測定心肌康顆粒中黃芪甲苷的含量[J]. 中國藥品標準，2007，8（2）：68.

[4] 潘宏林，張坦，趙云云. 不同提取方法對黃芪藥材中黃芪甲苷含量測定的影響[J]. 中藥材，2004，27（10）：774.

（收稿日期：2013-04-02）