ERCC1和CK在I期非小細胞肺癌中的表達對術后化療的指導研究

[摘要] 目的 探討I期非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Carcinoma，NSCLC）的術后個體化化療，以提高肺癌的遠期療效。方法 對該院2009年6月—2012年12月收治的78例Ⅰ期NSCLC且有微轉移患者的石蠟包埋腫瘤標本進行肺癌組織ERRC1（excision repair cross-complementation group 1）及細胞角蛋白（Cytokeratin，CK）免疫組化檢測，并進行術后個體化化療，分析上述指標表達對患者化療反應率及生存率的關系，探討其對指導術后化療的意義。結果 全部患者CK檢測均為陽性，陽性率100.0%；ERRC1陰性表達者42例（53.8%），ERRC2陽性表達者36例（46.2%）；2009年6月-2012年12月，共有235例Ⅰ期NSCLC患者在該院就診，經治療及CK檢測陽性確定微轉移患者共78例，轉移率33.2%；陽性組3年復發18例，轉移30例，生存率61.1%，陰性組復發20例，轉移34例，生存率69.0%，兩組患者復發、轉移、生存率比較均無明顯統計學差異。 結論 ERCC1和CK檢測有助于客觀評價患者預后，合理應用多學科綜合治療，避免不必要的醫療資源的浪費，具有巨大的經濟和社會效益，值得廣泛推廣。

[關鍵詞] ERRC1；細胞角蛋白；I期非小細胞肺癌；表達；化療；指導

[中圖分類號] R734 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）05（b）-0055-02

目前臨床對于I期非小細胞肺癌術后是否化療仍存在較大爭議，多數學者均認為[1]，微轉移是一個影響預后的獨立因素[1]，而目前臨床TNM分期仍未將微轉移作為一個分期的指標，因此，為探討微轉移患者個體化化療效果，該院對2009年6月-2012年12月收治的78例Ⅰ期NSCLC且有微轉移患者的石蠟包埋腫瘤標本進行肺癌組織ERRC1及CK免疫組化檢測，并進行術后個體化化療以期改善這部分患者的預后，現將研究過程與結論報道如下。

1 臨床資料

選取該院收治的經胸外科根治手術（肺葉或全肺切除、系統性淋巴結清掃術）且經常規病理檢查存在微轉移的I期NSCLC患者[2]，共78例，男性48例，占61.5%，女性30例，占38.5%，年齡39～71歲，平均年齡（55.8±13.6）歲。病理分型：鱗癌38例（48.7%），腺癌29例（37.2%），腺鱗癌11例（14.1%）；吸煙史：無吸煙史42例（53.8%），3年以下19例（24.4%），3年及以上17例（21.8%）。

2 研究方法

2.1 CK檢測

2.1.1 標本準備 將石蠟包埋組織標本置于-4℃冰箱內，冷凍后取出，制成2張組織薄片，厚度均為5 μm，將其置于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，經攤片、烤片后進行CK免疫組織化學染色。

2.1.2 免疫組織化學染色步驟 ①采用常規脫蠟法將石蠟切片水化；②將30% H2O21份與蒸餾水10份混合，室溫放置5～10 min以滅活內源性酶，滅活后使用蒸餾水清洗3次；③將切片浸入0.01 mol枸櫞性酸鹽緩沖液中，微波爐加熱至沸騰后停止，每隔10 min重復一次，共計2次。待切片冷卻后，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次；④滴加5%雙（三甲基硅基）乙酰胺（BSA）封閉液，室溫靜置20 min后甩去多余液體，無需洗滌；⑤滴加稀釋的一抗，37℃靜置1 h后，使用PBS洗滌3次，每次2 min；⑥滴加生物素化二抗，于室溫下靜置20 min后使用PBS洗滌3次，每次2 min；⑦滴加試劑SABC，20～37℃靜置20 min后使用PBS洗滌4次，每次5 min；⑧DAB顯色：取1 mL蒸餾水，分別添加加試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間在20 min左右，反應完畢后使用蒸餾水洗滌；⑨蘇木素輕度復染[3]；脫水，透明，封片，待檢。

2.1.3 染色結果評判標準 陽性結果為細胞膜及細胞漿出現棕黃色顯色，且切片中出現1例CK染色陽性的細胞，則認為結果呈陽性，即淋巴結中有微轉移灶的存在。

2.2 CK檢測陽性標本再行ERCC1檢測

2.2.1 方法 鼠抗人ERCC1單克隆抗體由上海長島生物技術有限公司提供。①石蠟切片經常規脫蠟水化后，使用3%的H2O2溫育20 min，以滅活其內源性過氧化物酶，使用蒸餾水洗滌3次，每次洗滌時間約為5 min；②微波抗原修復約5 min，使用0.1 mol/LPBS洗滌3次，每次5 min；③滴加正常血清封閉液，室溫溫育30 min后將多余液體倒出；④滴加1∶80鼠抗人ERCC1單抗（稀釋倍數1∶100），37℃1 h，4℃冰箱放置8～12 h；⑤0.1 mol/LPBS洗滌5 min，3次；⑥滴加生物素化二抗，37℃環境下靜置60 min；⑦0.1 mol/LPBS洗滌5 min ，3次；⑧滴加試劑SABC，37℃，60 min，使用0.1 mol/LPBS洗滌5 min ，3次；⑨DAB顯色5 min；⑩蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，待檢。

2.2.2 判定標準 ERCC1主要呈細胞核染色，在400×視野下，對1000個腫瘤細胞中陽性細胞數予以記錄。參照Wachters等[4]的方法來分析免疫組化ERCC1的表達水平，即陰性表達（-）：不表達或陽性細胞數<10%；陽性表達（+）：視野中陽性細胞>10%。按照其表達程度分為陰性組和陽性組，以進行分組治療。

3 治療方式

ERCC1陽性患者（陽性組）用不含鉑方案，ERCC1陰性患者（陰性組）用含鉑方案化療[5]。

4 觀察指標

統計I期非小細胞肺癌微轉移率，ERCC1陽性率及總體3年復發率、轉移率及存活率。

5 統計方法

對本臨床研究的所有數據采用SPSS13.0進行分析，對計數資料采用χ2檢驗，對計量資料采用t檢驗，檢驗水準設定為a=0.05，當P<0.05時，認為差異有統計學意義。

6 結果

6.1 CK檢測結果

全部患者CK檢測均為陽性，陽性率100.0%。

6.2 ERRC1及轉移率檢測

對患者行ERRC1檢測，顯示ERRC1陰性表達（低表達）者42例（53.8%），納入陰性組，ERRC2陽性表達（高表達）者36例（46.2%），納入陽性組；2009年6月—2010年12月，共有235例Ⅰ期NSCLC患者在該院就診，經治療及CK檢測陽性確定微轉移患者共78例，轉移率33.2%。見表1。

6.3 3年情況統計

陽性組3年復發18例，轉移30例，生存率61.1%，陰性組復發20例，轉移34例，生存率69.0%，兩組患者復發、轉移、生存率比較差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

7 討論

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率均已高居各類癌癥死亡率之首。而腫瘤出現淋巴結微轉移一般無明顯臨床表現，常規影像學及臨床病理學檢查不易發現。而多數肺癌患者在手術前已經存在區域淋巴結或骨髓、外周血微轉移灶，造成病死率居高不下。因此，探討檢測微轉移灶的新方法，補充完善病理TNM分期系統，對選擇適宜的綜合治療方法及延長其生存期均具有重要意義。2008年NCCN《非小細胞肺癌指南》[6]指出，IA期病變不需化療，IB期病變不推薦化療，但為提高患者預后，保證其生活質量及生存率，我們認為，應根據患者指標進行個體化治療，遂設計了本次探究。

CK是一種分化特異的蛋白質，是組成細胞骨架的蛋白質之一，廣泛存在于人體上皮組織中，而不存在于間葉組織中。但當細胞出現癌變時，上皮性腫瘤可表達CK，且間葉組織仍不表達，因此，可認為肺癌患者淋巴結中檢測到CK可指示腫瘤微轉移的出現。本例采用該理論，確診78例CK陽性微轉移患者，總體Ⅰ期NSCLC轉移率為33.2%，與Kim KS等[7]研究結果相仿，結果可靠。

ERCC1是一類重要的核苷酸外切修復酶，肺癌患者體內ERCC1一般呈現低表達，而高表達往往與鉑類制劑耐藥相關；鉑類是NSCLC化療的基本藥物，通過分析患者基因表達水平以及遺傳狀態，對設計是否選擇含鉑方案治療及預測鉑類藥物療效均具有指導意義，而且能夠在一定程度上避免藥物相關的嚴重毒副作用風險，從而使病人接受真正的個體化治療。目前，肺癌的分子分期及個體化治療是肺癌研究領域的難點和熱點，本例根據患者ERCC1表達差異制定不同的化療方案，即ERCC1陽性患者用不含鉑方案，ERCC1陰性患者用含鉑方案化療，最終陽性組復發率50.0%，轉移率83.3%，生存率69.4%，而陰性組復發率47.6%，轉移率81.0%，生存率73.8%，兩組組間數據比較無明顯差異，而通過對其他研究結論的對比分析[8]，我們發現，經個體化治療后，患者復發率、轉移率無明顯變化，而生存率較傳統治療方案上升約10%，說明檢測上述指標并進行合理化治療可有效提高患者的生存期，能夠為Ⅰ期NSCLC患者的術后化療提供可靠的臨床指導。

綜上所述，ERCC1和CK檢測有助于客觀評價患者預后，合理應用多學科綜合治療，避免不必要的醫療資源的浪費，具有巨大的經濟和社會效益，值得廣泛推廣。

[參考文獻]

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[2] Pesta M， Kulda V， Fiala O， et al. Prognostic Significance of ERCC1， RRM1 and BRCA1 in Surgically-treated Patients with Non-small Cell Lung Cancer[J]. Anticancer Res，2012，32（11）：5003-5010.

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[4] Nagakura H， Nishikawa M， Kusano N， et al. The Impact of a Negative History of Smoking on Survival in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer Detected with Clinic-based Screening Programs[J]. Intern Med， 2012，51（22）：3115-3118.

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[6] 陳佳， 何松， 張曉東， 等. 依據ERCC1及RRM1對晚期非小細胞肺癌實施個體化治療的隨機對照臨床研究[J].實用臨床醫藥雜志，2012，16（9）：21-24.

[7] Kim KS， Oh IJ， Ban HJ， Cho HJ， et al. Comparison of docetaxel/cisplatin dosages of 75/60 and 60/60 mg/m（2） for the treatment of non-small cell lung cancer[J]. Exp Ther Med，2012，4（2）：317-322.

[8] 閔凌峰， 徐興祥， 陳勇， 等. E-cadherin蛋白表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征及預后的聯系[J].中華肺部疾病雜志（電子版），2012，5（4） ： 8-12.

（收稿日期：2012-11-26）