鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性及其基因的分析

[摘要] 目的 探討分析鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性及其基因特征，為臨床合理應(yīng)用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。方法 使用法國梅里埃公司的VITEK TWO細菌鑒定系統(tǒng)進行菌株鑒定，以K-B法行耐藥試驗，使用碳青霉烯酶的4種基因特異型引物對鮑曼不動桿菌行基因型分析及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增，通過GenBank比對確認編碼酶基因的具體類型。結(jié)果 全部菌株中對多黏菌素B耐藥率最低為8.2%，對菌必治與亞胺培南的耐藥率最高為100%。結(jié)論 耐碳青霉烯類抗生素鮑曼不動桿菌對于多黏菌素的耐藥性最低，其次對丁胺卡那霉素的耐藥性較低；主要攜帶OXA-23型的碳青霉烯酶基因，應(yīng)提請臨床廣泛關(guān)注。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動桿菌；碳青霉烯類抗生素；耐藥性；基因

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2013）05（b）-0058-02

鮑曼不動桿菌（Ab）屬于一種非發(fā)酵型葡萄糖、革蘭染色呈陰性且無動力型的雙球菌或者球桿菌，廣泛的存在于人體與自然界當中[1]。鮑曼不動桿菌是一種重要的院內(nèi)感染病原菌，可導(dǎo)致院內(nèi)感染流行性爆發(fā)[2]。為積極預(yù)防流行性感染及臨床合理用藥，本院對Ab耐藥性及其基因特征進行深入分析，現(xiàn)將詳細情況總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究所用鮑曼不動桿菌為2011年1—12月間從本院臨床血液、痰液、尿液等標本中分離獲取的非重復(fù)菌株，挑選其中的30株。標準菌株為銅綠假單胞菌（ATCC27853）與大腸桿菌（ATCC25922）。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)備與引物 采用法國梅里埃公司的VITEK TWO細菌鑒定系統(tǒng)，專用試劑，MH、血培養(yǎng)基Oxoid公司出品，藥敏紙片使用英國Oxoid公司產(chǎn)品，PCR檢測使用美國PE公司出品的PCR儀，電泳使用Bio-Rad公司出品電泳儀，成像系統(tǒng)采用英國UVI凝膠成像分析系統(tǒng)，Premix Taq酶與DNA Marker DL2000均為Takapa公司產(chǎn)品。引物基因序列設(shè)計由引物搜索軟件Oligo -6.0完成，共設(shè)計4對引物分別為OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58，產(chǎn)物長度分別為501 bp、246 bp、353 bp、599 bp，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 菌株鑒定標準 Ab標本的采集與分離嚴格依照第3版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》執(zhí)行[3]。

1.2.3 耐藥試驗 采用K-B紙片擴散法檢測耐藥性，試驗操作與結(jié)果觀察均依據(jù)美國臨床實驗室2010年標準化研究所（CLSI）制定的相關(guān)判斷標準執(zhí)行。取耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的菌株接種于血平皿上，孵育18～24 h，取數(shù)個菌落入EP管中，加入150 μL滅菌蒸餾水，煮沸10 min即時于4℃條件下冷卻，以12000 r/min離心5 min后取上清液制備為PCR試驗?zāi)０澹?20℃條件下儲存?zhèn)溆谩Ｒ訮CR擴增法對碳青霉烯類的OXA基因進行檢測，加入25 μL 的Premix Taq酶體系，上下游引物分別1 μL，10 μL模板DNA，以ddH2O定容至50 μL，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為94℃、預(yù)變性為5 min、94℃變性為45 s、52℃退火45 s后于72℃下延伸1 min，如此循環(huán)35次后于72℃下延伸10 min，取5 μL 的PCR產(chǎn)物以1.5%的瓊脂糖凝膠行電泳分析。DNA序列分析，將PCR產(chǎn)物由上海英駿生物公司行純化與雙向測序，測序結(jié)果于GenBank中行blast比對，采取同源分析確定具體基因類型。

2 結(jié)果

2.1 耐藥性試驗結(jié)果

全部菌株中對多黏菌素B耐藥率最低為8.2%，對菌必治與亞胺培南的耐藥率最高為100%。見表1。

2.2 PCR結(jié)果

23株（79.2%）OXA-23引物的擴增結(jié)果呈陽性（圖1），PCR產(chǎn)物雙向測序后確定的OXA-23具體序列號為GQ849192，99%鮑曼不動桿菌同源；20株（66.7%）OXA-51引物的擴增結(jié)果呈陽性（圖2），PCR產(chǎn)物雙向測序后確定的OXA-51具體序列號為GQ525851，98%鮑曼不動桿菌同源；30株菌株擴增均未見OXA-24與OXA-58型的基因。

3 討論

鮑曼不動桿菌是院內(nèi)感染中一項重要致病病原菌，目前其在革蘭陰性桿菌導(dǎo)致的感染中的分離率已經(jīng)超過銅綠假單胞菌[4]。近些年來隨著廣譜抗生素的廣泛使用，鮑曼不動桿菌的耐藥性也日益提高，顯現(xiàn)為泛耐藥菌株的爆發(fā)性流行[5]。碳青霉烯類的抗生素有著更為高效、廣譜的抗菌作用。但新型抗菌藥物的出現(xiàn)也導(dǎo)致了細菌耐藥性的提高。近些年來關(guān)于鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素的病例日益增多，且感染后的預(yù)后較差。

該研究結(jié)果表明鮑曼不動桿菌對于亞胺培南耐藥，并且對其他臨床中常用的廣譜抗菌藥物均有較高的耐藥率，對于慶大霉素、妥布霉素、頭孢吡肟、復(fù)方新諾明等的耐藥率均達到90%以上，這為臨床抗帶來了極大的壓力。不動桿菌對于碳青霉烯類抗生素耐藥的機制十分復(fù)雜，主要是通過生成碳青霉烯酶發(fā)揮耐藥作用，碳青霉烯酶是一類能夠水解亞胺培南或者美羅培南的β-內(nèi)酰胺酶，主要包括Ambler分子中的A、B、D三種酶，D類酶可分為4組，第1組OXA-23包括23、49、27，同源性達99%；第2組OXA-24包括25、26、40同源性達98%；第3組OXA-51包括51、69屬天然產(chǎn)生；第4組OXA-58與上述3組同源性達50%。該研究結(jié)果表明OXA-23類基因的檢出率高達79.2%，OXA-51類基因的檢出率達66.7%，未見OXA-24與OXA-58類基因。

綜上所述，鮑曼不動桿菌對臨床中多數(shù)常用的碳青霉烯類抗生素均有較高的耐藥性，因此對鮑曼不動桿菌進行定期耐藥監(jiān)測并據(jù)此選用抗生素對臨床抗菌治療具有重要意義。

[參考文獻]

[1] 張玲玲，胡俊鋒，李峰，等.多耐藥鮑曼不動桿菌耐藥性分析和部分耐藥基因檢測[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6（15）：116-119.

[2] 侯明玖，曾明，侯玲俐，等.多重耐藥鮑曼不動桿菌耐消毒劑、滅菌劑基因研究[J].長江大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版：醫(yī)學(xué)卷，2012，9（4）：62-64.

[3] 嚴冰，韓艷萍，張代惠，等.耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染監(jiān)測分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2012，30（4）：327-329.

[4] 佘婷婷，沈繼錄，徐無宏，等.廣泛耐藥鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗生素膜蛋白機制研究[J].中國感染與化療雜志，2012，12（4）：280-284.

[5] 楊均均，黃文祥，史芳靜，等.耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌流行特征及耐藥基因分析[J].中國抗生素雜志，2012，37（5）：343-347，391.

（收稿日期：2013-03-07）