重組腺病毒介導P27mt基因增強宮頸癌放療療效的實驗研究

【中圖分類號】R711 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-3783（2013）12-0250-01

【摘要】目的 觀察P27mt基因對宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用。方法 MTT法檢測P27mt基因和放射線對Hela細胞的增殖抑制作用，繪制抑制率曲線圖研究P27mt基因與放射聯合應用時的作用特點；流式細胞法檢測細胞周期和凋亡。結果 單純照射對宮頸癌增殖有抑制作用，但有平臺效應；P27mt基因對Hela細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈時間和濃度依賴性；照射聯用P27mt基因可進一步增強對宮頸癌的殺傷效應；單獨照射和P27mt基因均能使細胞周期阻滯于放射敏感時相G2/M期，誘導細胞凋亡，聯用效果更加顯著。結論P27mt基因可通過阻滯細胞周期于G2/M期對宮頸癌Hela細胞產生放療增敏作用。

宮頸癌是我國也是本地區最常見惡性腫瘤，放射治療是重要治療手段，目前多采用同步放化療綜合治療模式，即通過同步應用小劑量化療藥物在不增加甚至降低射線劑量的基礎上達到增強放射線對腫瘤細胞的殺傷作用[1] 。

p27 基因是細胞周期素依賴性激酶抑制因子（CDKI） 家族成員之一，是一類重要的細胞周期調控基因，可廣泛抑制細胞周期素（ cyclin） 和細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK） 復合物的活性對細胞周期進行負性調控[2] 。Jean 等[3] 將p27 第187 位蘇氨酸置換成丙氨酸（T187A） 轉染HeyC2 細胞，發現細胞生長明顯抑制，證實突變p27 （p27mt） 比野生型p27 抑制作用更強。p27mt對宮頸癌放療作用如何未見有人報道，本文對此進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌Hela細胞株和p27mt 由湖北醫藥學院臨床研究所惠贈； Clinac 600C/D加速器（ 美國Varian 公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coluter公司）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 宮頸癌Hela細胞培養于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常規培養，每2-3d傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2照射方法 在室溫下采用6MV-X線照射，照射野10×10cm，劑量率40 cGy/min，源皮距為100cm，分別一次性給予各實驗組6、8、10、12、14、16Gy劑量。

1.2.3放射線對Hela細胞增殖的影響 取對數生長期Hela細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，參照文獻按輻射劑量分為6、8、10、12、14、16Gy共6組，每組設5個復孔，給予一次性射線照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），繼續孵育4h，棄各孔液體，每孔加入150μL二甲基砜，低速震蕩10min，酶標儀檢測各孔在562nm波長處吸光度值，計算抑制率，求出輻射劑量坪值，即細胞增殖抑制率達最高的射線劑量。細胞抑制率=（1-實驗組平均吸光度值/對照組平均吸光度值） ×100%。

1.2.4MTT法測定p27mt的輻射敏感性 取對數生長期細胞制成單細胞懸液，分為空白組、單藥組、單放組、藥放組。空白組只加細胞與培養液；單放組劑量取上述實驗的坪值；單藥組p27mt基因終濃度參照文獻[4] 確定為10、20，30，40，50MOL（感染復數）共5組，藥放組輻射劑量和藥物濃度分別同單放組劑量和單藥組濃度，共5組，每組設5個平行樣本，測定各組吸光值后通過公式計算細胞抑制率。

1.2.5細胞周期分析及凋亡檢測 細胞分組及處理同1.2.4，取處理完畢的4組細胞各1×106個， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定過夜，清除固定液，加入PBS100μl混勻細胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混勻，置37℃水浴鍋中加溫30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常溫避光30min后，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件分析，擬合計算出細胞各時相百分比和凋亡率。

1.3統計學分析 所得數據以均數±標準差（x±s）的形式表示，SPSS17.0軟件模擬生存曲線并進行單因素方差分析（兩兩比較采用S-N-K法），以P<0.05為差別有統計學意義，以P<0.01為差別有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 Hela細胞對射線照射的敏感性 射線照射對宮頸癌細胞增殖可產生明顯的抑制作用，在射線劑量12Gy以內時，隨著射線劑量的加大和照射后作用時間的延長，對細胞增殖的抑制率也明顯增加，呈現出一定的量效和時效關系。在12Gy處出現坪值，故選用12Gy加藥物進行后續的增敏實驗。

2.2p27mt基因對Hela細胞增殖的影響 經不同濃度p27mt作用24、48、72h后，Hela細胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈時間，濃度依賴性。各濃度姜黃素作用48h，細胞增殖抑制率在6%-78%之間，與對照組比較，20MOLp27mt基因即可產生有統計學差異的抑制作用（P<0.05），而20MOL及以上濃度的p27mt抑制作用則更強（P<0.01）。

2.3p27mt基因對Hela細胞的放射增敏作用 選取12Gy劑量射線加不同濃度p27mt基因作用于Hela細胞結果顯示出細胞增殖抑制率可進一步隨藥物濃度的增加而升高，當濃度大于40MOL時曲線趨于平坦。藥物加輻射后，其24h細胞增殖抑制率均較單純輻射或單純藥物組有統計學差異（P<0.05）。

2.4細胞周期分析及凋亡檢測 流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡結果表明，與空白組比較，單純放射或藥物均能提高G2/M期細胞比例，誘導細胞出現凋亡（P<0.05），而放射與藥物聯合則作用效果更為顯著（P<0.01）。

3討論

重組腺病毒作為一種高效基因轉移載體被廣泛用于將外源基因導入哺乳動物細胞，原因是腺病毒本身分子穩定，基因組不會發生重排，插入的外源基因也相當穩定，腺病毒允許插入的外源基因容量可達7.5Kb，不僅感染分裂期細胞，也可感染靜止期細胞，感染率幾乎100 % 。另外，它不與宿主基因組整合，沒有基因毒性，比較安全。因此本研究擬通過腺病毒將突變型p27基因和X射線聯合作用宮頸癌Hela細胞株模型，通過檢測其放射敏感性及細胞周期及凋亡的改變，探討p27基因放射增敏的作用及機制，為在臨床上將突變型p27做為宮頸癌放療增敏劑提供理論依據。研究結果顯示，單純應用p27mt，細胞增殖抑制率與藥物濃度的增加成正比；單純應用放射線照射，細胞抑制率也隨射線劑量的增加而增加，但當輻射劑量達到12Gy時細胞增殖抑制率達到坪臺期，不再隨射線劑量的加大而增加。在此基礎上，選用12Gy放射線聯合不同濃度的p27mt做進一步的觀察，結果顯示，在單純輻射劑量已達到“閾值”的情況下，聯用p27mt仍可使細胞增殖抑制效果得到進一步的提高，且對細胞增殖的抑制率高于單純放射組和單純藥物組（P<0.05），說明同步應用p27mt確實可對宮頸癌細胞放療產生增效的作用，但這種增效作用只是控制在一定濃度的范圍之內。

為初步探明增效機制，筆者進一步檢測了p27mt同步放療后對宮頸癌細胞凋亡和細胞周期的影響，結果發現，單獨p27mt、單獨射線均能對細胞產生誘導凋亡和G2/M期阻滯的作用，而聯合應用后作用效果更為顯著，這說明p27基因可能通過阻滯細胞周期于對G2/M期達到放療增敏的作用。

參考文獻

[1]徐鳳華，郭榮榮，孫華燕.吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌的系統評價[J].中國循證醫學雜志，2009，9（2）：218-229.

[2]Troncone G，Martinez JC，et al， P27kip1 is expressed in proliferating cells in its form phosphorylated on threonine 187. BMC Clin Pathol， 2005， 5（2）：3-5.

[3]Jean A，Hurteau MD，Susan A，et al，Over expression of a stabilized Mutant form of the cycli - dependent kinase inhibitor p27kip1 inhitits cell growth[J].Gynecologic oncology，2002， 86（1）：19-23.

[4]陳珺，徐少勇，鄧長生.人突變p27基因轉染對大腸癌SW480細胞黏附作用的影響[J].實用癌癥雜志，2005，20（2）：138-140.