纖支鏡毛刷細胞塊技術的應用方法和價值

[摘要] 目的 探討纖支鏡毛刷細胞塊技術的應用方法和價值。 方法 對32例纖支鏡毛刷常規涂片后再將剩余細胞用10%中性福爾馬林固定制成細胞蠟塊（cell block，CB），先行常規HE染色，再根據需要選擇酶標行免疫組化。 結果 CB常規HE染色細胞清晰，有一定的組織學結構，有利于明確診斷；免疫組化則陽性定位準確，著色清晰，對腫瘤分型效果較好。兩種染色方法染色效果均好于常規涂片，差異有顯著統計學意義（P < 0.01），與肺活檢及術后組織切片差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 用10%中性福爾馬林固定的纖支鏡毛刷CB的制作方法簡便、經濟、染色效果好，在診斷肺疾病、特別是肺腫瘤中有較高的實用價值和廣闊的應用前景，值得推廣。

[關鍵詞] 纖支鏡毛刷；細胞塊；常規HE染色；免疫組化；10%中性福爾馬林

[中圖分類號] R446.6；R361.3 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）36-075-03

The application methods and value of fiber lens brush cell block technique

ZHANG Guizhen ZHU Zhenda CHEN Cheng

Department of Pathology， Yuhang District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City in Zhejiang Province， Hangzhou 311106， China

[Abstract] Objective To study the application methods and value of fiber lens brush cell block technique. Methods For 32 cases of fiber lens brush after conventional smear in the remaining cells again fixed with 10% formaldehyde wax block made from cells （cell block， CB）， the first routine HE staining， again to choose according to the need to enzyme immunohistochemical marking line. Results CB routine HE staining cells clear， histologic structure to a certain extent， was conducive to clear diagnosis； Immunohistochemical positive for accurate positioning， color clear， has good effect for tumor classification. Two dyeing methods were better than regular smear dyeing effect， so the significant difference of statistically was significant （P < 0.01）， and the lung biopsy and postoperative biopsy difference was not significant （P > 0.05）. Conclusion The production method of the fiber lens brush CB fixed with 10% of formaldehyde is simple， economic and The dyeing effect is good， in the diagnosis of pulmonary diseases， especially lung cancer has a high practical value and broad application prospect， the production method is worth promoting.

[Key words] Fiber lens brush； Cell block； Routine HE staining； Immunohistochemical； 10% formaldehyde

纖支鏡毛刷細胞學檢查是診斷肺疾病、特別是肺腫瘤的重要手段之一，已被廣泛用于臨床，當纖支鏡活檢和經皮肺穿刺活檢由于多種因素被迫放棄，此時的纖支鏡毛刷細胞學檢查是術前最佳的病理檢查方法，顯得尤為重要，并對已不適合手術治療的老弱患者和晚期癌癥患者來說也是較佳的病理檢查方法。筆者對32例纖支鏡毛刷常規涂片后再將剩余細胞制成細胞蠟塊（cell block，CB），先行常規HE染色鏡下觀察，再根據需要選擇酶標行免疫組化（如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等），兩者結合觀察，對肺疾病進行病理診斷，特別是對肺腫瘤進行組織學上的分型，效果較好，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

50 mL尖底塑料試管1支，直立平衡離心機1臺，盛10 mL 10%中性福爾馬林的小瓶1只，老虎鉗1把，震蕩器1臺。

1.2 方法

1.2.1 毛刷處理 毛刷刷取細胞后快速涂片2張，95%乙醇迅速固定，常規HE染色。涂片后馬上用老虎鉗剪斷毛刷放入盛有10 mL的10%中性福爾馬林的瓶內固定。

1.2.2 制片方法 毛刷在10%中性福爾馬林液固定1 h后用干凈的鑷子取出，用針尖挑（或刮）出刷內物，盡量挑干凈，再把毛刷在固定液內漂洗，而后把固定液倒入試管內。再重新倒入10 mL左右的10%中性福爾馬林在瓶內，在震蕩器上震下刷內殘余的細胞，再把這10 mL的中性福爾馬林倒入同試管內，再加一定的量，使試管內的福爾馬林總量達30～40 mL，離心3000 r/min、15 min，取出放在試管架上固定2～4 h左右，如標本上午送來的則當天即可與常規組織同脫水，如下午兩三點后送來則固定過夜。固定好后倒去固定液，此時沉淀物已結塊，小心取出，放在濾紙上滴入伊紅包好，與常規組織同時進行脫水、包埋予0.4 mm厚連續切片8張左右，其中1張常規HE染色鏡下觀察，再根據需要選擇酶標行免疫組化。

1.2.3 染色合格標準 將常規HE合格標準定為：細胞清晰，核漿對比分明，組織學結構可有（或無），有利于明確診斷。將免疫組化合格標準定為：陽性定位準確，著色清晰，有助于腫瘤的分型。

1.2.4 免疫組化方法 CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、 34βE12、TTF-1等單克隆抗體購于北京中杉公司，實驗流程采用EnVision二步法。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS16.0統計學軟件處理。用Kolmegorov-Smirnov方法進行正態性檢驗，使用χ2檢驗對正態分布的構成比進行比較，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

40例肺纖支鏡毛刷，先直接常規涂片，再將剩余細胞用10%中性福爾馬林固定制成細胞蠟塊（CB），除8例由于細胞數量過少或血過多等原因使CB制作失敗外，成功的32例常規HE染色效果較好，細胞較清晰，有一定的組織結構；免疫組化則陽性定位準確、著色較清晰，與常規涂片相比差異有統計學意義（P < 0.01）、與肺活檢（或術后組織切片）相比差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1 三種不同方法檢測結果比較[n（%）]

圖1、2 CB中的片狀異型鱗狀上皮組織，HE，×10與×40

圖3 CB中的正常腺管狀結構，HE，×40

圖4 CB中的支氣管黏膜，×10

圖5 活檢中的支氣管黏膜，×10

圖6 術后常規切片對照，HE，×40

圖7 直接常規涂片對照，HE，×40

圖8 34βE12在CB中的（與圖1同片）陽性表達，Envision法，×10

圖9 34βE12在直接常規涂片中的陽性表達，Envision法，×10

圖10 34βE12在術后常規切片中的陽性表達，Envision法，×10

圖11 CB中的片狀鱗狀上皮（右下）與壞死組織（左上）分界清，×10

圖12 術后切片中的鱗狀上皮（上）與壞死組織（下）分界清，×10

3 討論

3.1 纖支鏡毛刷細胞塊的HE染色效果

本方法制作的CB在HE染色上與文獻報道[1]的相似：細胞境界、核膜、核染質、核仁清楚；也有一定的巢狀、片狀、管狀結構組織學結構和排列方式[2]（圖1、2、3、4），等同活檢（圖5）和術后切片（圖6）的圖像，兩者染色效果對比差異無統計學意義（P > 0.05）。而直接常規涂片最大的缺陷是細胞量少，很難看到組織學結構[3]，我們觀察的病例大多似此，且常伴有細胞退變（圖7），常與壞死物、血細胞混合，干擾細胞的分辨，給診斷帶來一定的困難，兩者染色效果對比差異有統計學意義（P < 0.01）。

3.2 纖支鏡毛刷細胞塊的免疫組化效果

本方法制作的CB在免疫組化上陽性定位準確，著色清晰，背景也清晰無干擾（圖8），與活檢和術后切片（圖10）相似，兩者染色效果對比差異無統計學意義（P > 0.05）。而常規涂片免疫組化出現高背景染色，細胞集群呈三維結構，尤其是膜著色的更難判斷[4]，著色有模糊朦朧（圖9）的感覺，給判斷帶來一定的困難，兩者染色效果對比差異有統計學意義（P < 0.01）。

3.3 纖支鏡毛刷細胞塊的制作體會

纖支鏡毛刷常規涂片后再把毛刷內殘留的物質挑（或刮）出再離心制成細胞塊，優良的纖支鏡毛刷技術和小心、耐心挑（或刮）出刷內殘留物使有足夠量的腫瘤細胞是成功制成CB的主要環節。毛刷內物固定1 h左右后有一定硬度，易于挑（或刮）出，刷內物直接挑（或刮）出，對成小片狀、小粒狀刷下組織的破壞較小，很好地保存了原有的組織學結構（圖4），再利用離心機的離心力把漂下、震下的分散細胞經過高度濃縮壓緊，也一定程度地顯示了組織學模式，并能顯示涂片中不能顯示的特征性組織結構，如鱗癌的角化珠、乳頭狀結構、腫瘤的組織間質等[5]，又如我們觀察到的片狀上皮成分與壞死組織分界清（圖11）及較完整的黏膜結構（圖4）的圖像，與活檢（圖5）和術后切片（圖6、圖12）極其相似，且又不浪費所刷取的任何材料。而直接常規涂片最大的缺陷是材料浪費，細胞量少，又很難看到組織學結構。現雖有較先進的液基細胞學技術，但經過振蕩，標本中組織學結構大部分被離散，涂片中也很難看到組織學結構，又經過膜式過濾后，細胞量也相應減少，對刷取的材料仍有浪費。

我們不用95%乙醇固定，用10%中性福爾馬林固定，是因為高濃度的乙醇可使組織細胞收縮和變脆，難以切片外，還可溶解紅細胞中的血紅蛋白[6]，在免疫組化染色時會干擾背景加重背景著色。有文獻報道脫落細胞有完整的細胞膜，雖經乙醇固定，其包膜上的類脂質不能充分溶解，影響試劑的滲透造成真正的陽性細胞著色不良，影響結果判斷[7，8]。10%中性福爾馬林對組織滲透作用強，固定均勻、穩定，使組織具有一定的彈性，不僅易于切片外，還能很好地保存組織細胞的形態結構、保存大部分組織細胞內的物質如糖類、無機鹽、色素、蛋白抗原等，使抗原定位更加清晰，尤其是對細胞核的抗原固定最佳[9]，利于進行免疫組化染色和分子生物學檢驗。我們制作和觀察的病例大多有類似的結果，免疫組化效果較佳（圖10）。但福爾馬林滲透速度較乙醇慢，所以固定時間較長，一般要2～4 h[10]，如果急需加快，也可采用付海洋等[9]介紹的方法：在前固定的基礎上再利用超聲波進行后固定，加速福爾馬林對細胞的滲透和固定。另有文獻報道常規涂片免疫組化細胞成分復雜，除有較強的非特異性背景著色外，三維細胞團免疫試劑容易進入產生假陽性[11]；CB免疫組化染色則背景干凈，幾乎沒有假陽性[12]。

3.4 纖支鏡毛刷細胞塊的應用前景

細胞塊作為細胞學診斷中重要的輔助手段最初應用于胸腹水、心包積液等液體標本，在國外該技術已經成為脫落細胞學的常規操作技術，并已應用很久，目前國外普遍采用自動化制作細胞蠟塊，但該方法設備成本較高且技術較為復雜[13]。傳統的細胞塊制作方法有瓊脂或生物膠水包埋法、固定沉降法、血漿凝血酶凝集法、雞蛋清凝集法和醫用脫脂棉吸附法，不僅操作復雜，且通透性較差，影響脫水、透明和浸蠟，造成制片困難和染色效果差[14，15]。我們制作的方法較為簡便，只需1臺離心機用10%中性福爾馬林固定，2～3 d即可完成常規HE染色和免疫組化染色，并因未用任何媒介物，干擾圖像較少，染色效果較佳，更易于鏡下觀察。CB還有優點是可以連續切片，用于多種酶標檢測，如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等診斷肺腫瘤的酶標均可用上，以滿足診斷需要。并可長期保存，其成本對實驗而言也是最經濟的。已有文獻報道CB用于原位雜交檢測定位準[16]，因條件限制，我們尚未開展，但是我們以后努力的方向。所以用10%中性福爾馬林固定的纖支鏡毛刷CB方法簡便、經濟、效果好，在診斷肺疾病、特別是肺腫瘤中有廣闊的應用前景，值得推廣。

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（收稿日期：2013-07-15）