漢黃芩素對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡、Survivin及Caspase—3表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討漢黃芩素在人膠質(zhì)瘤患者中對U251細(xì)胞的增殖與凋亡及對存活素（Survivin）及半胱天冬酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響。 方法 不同濃度漢黃芩素作用于人膠質(zhì)瘤96株U251細(xì)胞，并與使用替莫唑胺（TMZ）的陽性對照組（48株）及未給予任何藥物的空白對照組（48株）對比細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及Survivin和Caspase-3蛋白的表達(dá)強度。 結(jié)果 各濃度漢黃芩素對細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組，且隨藥物濃度及作用時間的增加呈現(xiàn)出顯著增高趨勢（P < 0.05），漢黃芩素組細(xì)胞凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01），TMZ組顯著高于空白對照組（P < 0.01），在漢黃芩素組內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增加顯著增加（P < 0.05）；漢黃芩素組Survivin表達(dá)強度顯著低于TMZ及空白對照組（P < 0.01）；兩藥物組Caspase-3表達(dá)強度顯著高于空白對照組（P < 0.01）。 結(jié)論 漢黃芩素可通過調(diào)節(jié)Survivin、Caspase-3蛋白的表達(dá)對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 漢黃芩素；膠質(zhì)瘤；U251；增殖；凋亡；Survivin；Caspase-3

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0005-03

膠質(zhì)瘤是最為常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，膠質(zhì)瘤占腦腫瘤總數(shù)的50%～55%。該腫瘤呈浸潤性生長，手術(shù)難度較大，生物學(xué)特性復(fù)雜，放化療不敏感，療效差，預(yù)后差[1]。近年來，隨著對膠質(zhì)瘤研究的深入，特別是對中藥或中藥提取活性單成分的研究均表明其具有多種抗腫瘤活性，且副作用少。漢黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩及半枝蓮的活性提取物，其抗腫瘤活性近年來受到廣泛關(guān)注[2]。筆者使用漢黃芩素溶液處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，以探討其對U251細(xì)胞增殖與凋亡及對Survivin及Caspase-3表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

中科院上海細(xì)胞庫提供的人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞192株，Gibco BRL公司提供的RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清（FBS）、胰酶-EDTA混合液、PBS緩沖液（1×），北京索萊寶科技有限公司提供的青鏈霉素混合液（100×），Abcam公司提供的β-actin小鼠單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供的Survivin兔多克隆抗體、CCK8試劑盒，Millipore公司提供的PVDF膜，美國Pierce公司提供的BCA蛋白測定試劑盒，漢黃芩素由中國食品藥品檢定研究院提供（批號：111514-200403），替莫唑胺膠囊（TMZ）由江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞復(fù)蘇并接種于含10%新生胎牛血清和含1%鏈霉素、青霉素的RPMI 1640（1∶10混合）完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下進行傳代培養(yǎng)孵育，以0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞貼壁覆蓋80%～90%時進行實驗。漢黃芩素及TMZ用DMSO溶解為100 mmol/L的母液，儲存于4℃恒溫箱內(nèi)，使用前進行稀釋。U251細(xì)胞株分組：漢黃芩素組96株，TMZ組48株，空白對照組48株。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Survivin以及Caspase-3表達(dá)情況檢測 CCK8法測定計算細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率，Western blot測定Survivin及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率比較

漢黃芩素各濃度對細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對照組，且抑制率隨著藥物濃度及作用時間的增加呈現(xiàn)出顯著增高趨勢[t12.5μmol/L=2.769 6（24～48 h），2.544 1（48～72 h），P12.5μmol/L=0.008 1（24～48 h），0.014 4（48～72h）；t25μmol/L=2.161 1（24～48 h），2.128 2（48～72 h），P25μmol/L=0.035 9（24～48 h），0.038 7（48～72 h）；t50μmol/L=2.068 7（24～48 h），2.071 1（48～72 h），P50μmol/L=0.031 7（24～48 h），0.044 0（48～72 h）；t100μmol/L=8.196 3（24～48 h），4.673 6（48～72 h），P100μmol/L=0.000 0（24～48 h），0.000 0（48～72 h）]。100 μmol/L漢黃芩素組的細(xì)胞增殖抑制率與TMZ組大致相當(dāng)，僅48h具有顯著差異（t = 2.1834，P < 0.05）；漢黃芩素組同一時間內(nèi)抑制率隨著藥物濃度的增加而呈現(xiàn)出顯著增高趨勢[t24h=7.635 5（12.5～25 μmol/L），6.3687（25～50） μmol/L，6.664 9（50～100） μmol/L，P24h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L；t48h=6.682 8（12.5～25） μmol/L，3.753 4（25～50） μmol/L，6.855 5（50～100） μmol/L，P48h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.0005（25～50） μmol/L，0.0000（50～100） μmol/L；t72h=7.389 5（12.5～25） μmol/L，5.034（25～50） μmol/L，10.592 8（50～100） μmol/L，P72h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L]。

2.2 細(xì)胞凋亡率比較

漢黃芩素組及TMZ組細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對照組（P < 0.01）；同濃度的漢黃芩素造成的凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01）；在漢黃芩素組內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增加而呈現(xiàn)出顯著差異（P < 0.05）。

2.3 藥物作用48 h Survivin表達(dá)情況比較

兩組藥物處理組Survivin蛋白表達(dá)強度均顯著低于空白對照組（P < 0.01），且漢黃芩素組顯著低于TMZ組（t =8.365 0，P = 0.000 0）。

2.4 藥物作用48 h Caspase-3表達(dá)情況比較

漢黃芩素組及TMZ組Caspase-3蛋白表達(dá)強度均顯著高于空白對照組（P < 0.01）；TMZ組與漢黃芩素組Caspase-3蛋白表達(dá)強度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.864 7，P =0.388 6）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最為常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，其治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題。膠質(zhì)瘤因其生物學(xué)特性及病理生理特點均較為復(fù)雜，且呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織界限不明確，從而對該病的手術(shù)切除造成極大困難，本病對放射治療敏感性較低，療效較差，而化療雖然能夠起到一定作用，可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，但同時對機體正常細(xì)胞的毒性作用也較為明顯，權(quán)衡利弊，獲益較少[3]。該病惡性程度較高，進展迅速，預(yù)后不良，且具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率，因此，新型藥物的研發(fā)迫在眉睫。人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株與人實質(zhì)性腫瘤性質(zhì)相似，是研究膠質(zhì)瘤的常用細(xì)胞株。通常細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡是一個正常的生理過程，可以消除不必要的細(xì)胞，維護組織的動態(tài)平衡。如果能夠?qū)?xì)胞增殖與凋亡之間的平衡進行調(diào)節(jié)，則可對腫瘤的生長進行有效干預(yù)，因此可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及程序性死亡等途徑對癌癥進行治療[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的一員，但又與凋亡蛋白家族其他成員有所不同，是被克隆出來的一種凋亡抑制蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡，且具有腫瘤特異性，在正常組織中不表達(dá)，僅在胚胎發(fā)育組織及多數(shù)人類腫瘤組織中有不同程度表達(dá)，與多種癌細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移均具有密切相關(guān)。且Survivin在癌癥患者體內(nèi)的過度表達(dá)將導(dǎo)致不良預(yù)后，同時還與放化療耐藥性密切相關(guān)[5]。Caspase是存在于角質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)相關(guān)半胱氨酸蛋白酶，屬于一種促凋亡因子，Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中起著不可替代的作用[6，7]。生理條件下Caspase-3以無活性的Caspase-3酶原形式存在，僅在細(xì)胞凋亡早期被上游蛋白酶切割方可被激活，激活后即可對胞漿胞核底物進行裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

漢黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩的活性提取物，其中抗腫瘤活性近年來引起了廣泛關(guān)注。目前關(guān)于該物質(zhì)抗膠質(zhì)瘤的機制并不清楚，學(xué)術(shù)界對此也未達(dá)成共識。但多家研究已證實，漢黃芩素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[9，10]。而關(guān)于漢黃芩素作用于Survivin及Caspase-3從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、促進膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的研究卻鮮有報道。筆者采用不同濃度漢黃芩素作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素抑制U251細(xì)胞增殖呈濃度及作用時間依賴性；而且應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)漢黃芩素作用于U251 48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。為了進一步研究漢黃芩素抗膠質(zhì)瘤作用的分子機制，本實驗先后采用Western blot及半定量RT-PCR檢測細(xì)胞中Survivin及Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，漢黃芩素可下調(diào)Survivin、上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，上述作用與TMZ相當(dāng)甚至更具優(yōu)勢。Survivin抗細(xì)胞凋亡作用的機制可能是[11]：①通過結(jié)合細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，釋放p21，進而使CDK4與Procaspase-3相互作用達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用；②通過桿狀病毒的IAP重復(fù)序列分子中的Trp67、Pro33、Cys84等氨基酸殘基與Caspase-3結(jié)合從而抑制Caspase-3活性，進而抑制由Caspase-3導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。本次研究結(jié)果顯示，漢黃芩素能夠下調(diào)Survivin、上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，因此即可通過上述兩種可能的機制降低Survivin對細(xì)胞凋亡的抑制作用，而增強Caspase-3導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而促進腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，漢黃芩素具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的作用，同時可通過作用于Survivin、Caspase-3等蛋白的表達(dá)對U251細(xì)胞凋亡或增殖起到一定調(diào)節(jié)作用。

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（收稿日期：2013-03-06）