SphK1突變抑制高糖培養的系膜細胞纖維連接蛋白過度表達的研究

[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）突變是否抑制了高糖培養的系膜細胞中纖維連接蛋白（FN）的過度表達。 方法 采用Western blot檢測FN的表達。 結果 系膜細胞轉染了SphK1突變質粒后可消除高糖誘導的FN上調效應。 結論 本研究結果證明了SphK1在高糖誘導的系膜細胞FN表達過程中發揮著重要的調節作用。

[關鍵詞] SphK1；纖維連接蛋白；系膜細胞

[中圖分類號] R587.2；R692.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0010-02

系膜細胞（Mesangial cell，MC）是腎小球的主要功能細胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發揮著重要的作用；現已認為MC主要參與了糖尿病腎病腎小球硬化損傷過程。FN是由系膜細胞產生的細胞外基質的重要成分之一，在糖尿病狀態下，腎小球系膜細胞FN等細胞外基質的積聚，導致腎小球硬化、促進糖尿病腎病的病變進程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase， SphK）是催化S1P生成的關鍵限速酶[2]。我們前期研究表明：用四氧嘧啶誘導糖尿病小鼠模型12周后，模型組小鼠在腎小球結構異常、腎功能降低的基礎上，SphK1蛋白表達與活性較正常組相比明顯升高；免疫組化結果顯示，小鼠腎組織的SphK1主要表達于腎小球細胞，而模型組與正常組相比顯著升高[3]，提示在糖尿病狀態下SphK1的激活可能參與了糖尿病腎病的病變進程。本研究重點觀察SphK1對細胞外基質主要成分-FN的調節作用，探討糖尿病狀態下高糖激活的SphK1對系膜細胞FN生成的具體分子機制。

1 材料與方法

1.1 腎小球系膜細胞原代培養

采用逐級過篩法從SD大鼠的腎臟分離得到腎小球，用完全培養基（DMEM+20%胎牛血清+胰島素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL）約2滴，用吸管重懸腎小球，加入塑料培養瓶中，向各方向輕輕轉動培養瓶，使含腎小球的細胞懸液均勻分布于瓶底，待細胞懸液近干時，然后迅速倒轉培養瓶（使培養面朝上），加入約5 mL完全培養液，放入CO2孵箱內培養，4 h后，再輕輕將培養瓶翻轉過來。待原代腎小球系膜細胞長滿瓶底后，吸棄培養瓶內的培養基，用PBS沖洗培養瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化約1～3 min，鏡檢發現細胞突起回縮，細胞間隙增大，或輕輕振動后絕大部分細胞懸浮、漂移，立即加入含血清培養基終止消化，于1000 rpm離心5 min，傳代培養基懸浮GMC至所需濃度，按1∶2比例傳代培養。實驗采用第3代到第15代之間的細胞。

1.2 質粒和瞬時轉染

空載體（Vector），突變型質粒（SphKG82D）由澳大利亞Dr. Pu Xia贈送。按照產品說明書采用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉染系膜細胞72 h后收集細胞。

1.3 Western blot

細胞經裂解提取蛋白后，經SDS-PAGE電泳分離后，轉膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，將一抗、二抗孵育后，采用增強型的化學發光液檢測條帶信號。膜重孵鼠單抗 α-tubulin作為內參對照。

1.4 統計學分析

數值采用均值±標準差表示。采用單因素方差分析結合Bonferroni校正分析多組間的統計學差異，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

SphK1突變抑制了高糖誘導MC的FN表達，MC分別轉染空質粒Vector和突變型質粒SphKG82D。結果表明，高糖能明顯上調FN的表達；轉染了SphKG82D質粒后顯著抑制了高糖誘導的FN表達，而轉染Vector質粒無此效應，證明SphK1參與了高糖誘導的FN表達。

3 討論

系膜細胞是腎臟的主要功能細胞，糖尿病狀態下，腎小球系膜細胞FN等細胞外基質成分的積聚是導致腎小球硬化、促進糖尿病腎病病變形成的重要特征。因此，我們采用體外實驗進一步探討高糖環境下腎小球系膜細胞S1P信號通路的激活與細胞外基質成分FN生成的關聯性，以明確高糖激活的S1P信號通路參與糖尿病腎病病理進程的作用機制。

SphK1是催化S1P生成的關鍵酶[2，4，5]。研究表明：長期高血糖、AGEs、氧化應激等可激活SphK1，進而導致S1P的生成增加[6-9]。以往研究表明S1P在腎小球系膜疾病中起著重要作用[10-12]。外源性S1P可顯著促進GMC增殖[10-12]，導致腎臟疾病的發生。

近年來，SphK1-S1P信號通路與包括糖尿病腎病在內的糖尿病性血管并發癥的關系日益受到關注，成為相關領域研究的熱點。慢性高血糖現被認為是糖尿病微血管及大血管病變的主要致病因素；血管內皮損傷是導致糖尿病慢性血管病變的起始環節[13]。研究發現，高血糖能夠誘導內皮細胞SphK1的活化，參與了內皮損傷過程。同樣在高糖培養的內皮細胞中SphK活性也有顯著增加，采用siRNA技術證明高糖主要激活SphK16。高血糖狀態下形成的AGEs現已證明是外周微血管病變的主要致病因素之一，導致糖尿病腎病和終末期腎衰竭。Geoffroy等用AGEs處理GMC，發現當AGEs低濃度時，神經酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明顯升高，導致S1P積聚，誘使GMC增殖。Geoffroy隨后觀察了STZ誘導小鼠4 d后腎臟中SphK1活性和S1P含量的變化，結果發現隨著腎小球系膜細胞輕度增殖，腎臟中SphK1活性和S1P均顯著增加，提示SphK1-S1P信號通路可能參與了糖尿病腎小球增殖過程[8，9]。

本研究發現：在正常糖培養情況下，MC經過高糖培養后，FN的表達顯著升高，而轉染突變型質粒SphKG82D的MC，幾乎完全抵消高糖誘導的MC中FN上調效應，提示高糖誘導的FN過度表達需要SphK1的參與調節，為探尋將SphK1-S1P信號通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點奠定基礎。

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（收稿日期：2013-04-03）