雄激素受體敲除小鼠睪丸生精功能變化及p63的表達(dá)

[摘要] 目的 研究雄激素受體（AR）敲除小鼠睪丸生精功能及p63在曲細(xì)精管中表達(dá)的改變。 方法 采用雄性Flox-AR小鼠與雌性ACTB-Cre小鼠交配，并敲除胚胎中AR，篩選AR敲除（AR敲除組）和AR未敲除（對(duì)照組）雄性小鼠各10只，對(duì)比睪丸曲細(xì)精管生精功能及p63的表達(dá)。 結(jié)果 兩組小鼠曲細(xì)精管內(nèi)徑、管周膜厚度、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)、生殖細(xì)胞成熟度評(píng)分及總Makler評(píng)分之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），p63的陽(yáng)性表達(dá)主要位于精原細(xì)胞及精母細(xì)胞，精子細(xì)胞及成熟精子中表達(dá)呈陰性，且AR敲除組表達(dá)陽(yáng)性率及HSCRE評(píng)分均顯著低于對(duì)照組（P < 0.01）。 結(jié)論 AR表達(dá)與小鼠睪丸曲細(xì)精管p63表達(dá)關(guān)系密切，AR敲除小鼠睪丸曲細(xì)精管生精功能受損、p63表達(dá)下調(diào)，p63調(diào)控生殖細(xì)胞的早期分化。

[關(guān)鍵詞] 雄激素受體；基因；p63；生精功能

[中圖分類號(hào)] R698.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）34-0001-03

The testicular spermatogenic function and expression of p63 in androgen receptor knockout mouse

ZHENG Chunwei CHEN Yu FENG Yibo HUANG Qiang

Laboratory Animal Center of Zhejiang Province Traditional Chinese Medicine Academy， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To study spermatogenesis and p63 expression in the seminiferous tubules of the testicular androgen receptor （AR） knockout mice. Methods Male Flox-AR mice mated with female ACTB-Cre mice， and knocked the AR in addition to embryos， screening AR knockout male mice （ARKO group） and AR did not knock （control group），each of 10 mice. Contrasted testis seminiferous tube spermatogenic function and p63 expression. Results The differences of seminiferous tube diameter， the peritubular film thickness， wall germ cell layers， the germ cell maturity score and Makler score between two groups were statistically significant （P < 0.05）， p63 mainly expressed in spermatogonia and spermatocytes， expressed in sperm cells and mature sperm were negative， and AR knockout group expression the positive rate and HSCRE of scores were significantly lower than the control group （P < 0.01）. Conclusion AR expression in mouse testis seminiferous tubules are closely related p63 expression. AR knock damage in addition to the mouse testis seminiferous tube spermatogenic function of p63 downregulation of p63 regulation of the early differentiation of the germ cells.

[Key words] Androgen receptor； Gene； p63； Spermatogenic function

雄激素主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，誘導(dǎo)男性性別的分化，促進(jìn)內(nèi)生殖器發(fā)育，進(jìn)入曲細(xì)精管促進(jìn)生精細(xì)胞的分化和精子生成[1]。雄激素受體（androgen receptor，AR）主要分布于睪丸內(nèi)支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、管周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等組織，與雄激素結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，介導(dǎo)雄激素發(fā)揮一系列的生物學(xué)作用，對(duì)性別分化、男性性成熟及精子生成有重要作用，AR突變導(dǎo)致與雄激素結(jié)合力或受體轉(zhuǎn)錄后的活性發(fā)生改變，從而影響男性生育能力[2]。有研究表明，AR缺陷的小鼠可能出現(xiàn)睪丸顯著縮小，前列腺、附睪、精囊等組織的缺如，血清睪酮水平降低[3]。其作用的途徑和方式的研究對(duì)了解男性生殖系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的意義。p63與抑癌基因p53同源，在不同的組織和不同發(fā)育階段具有不同的生物學(xué)功能。p63在胚胎的外胚層和表皮組織基底層和生發(fā)層中顯著表達(dá)，通過(guò)其編碼的活性產(chǎn)物調(diào)節(jié)胚胎形成期外胚層的分化，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育階段，調(diào)控各種上皮組織的正常發(fā)生和分化，并維持細(xì)胞的形態(tài)，是胚胎發(fā)育過(guò)程中上皮分層所必需的蛋白質(zhì)[4，5]。p63缺陷小鼠皮膚及泌尿生殖道上皮出現(xiàn)發(fā)育不全[6]。本研究于2012年1～12月進(jìn)行AR敲除小鼠睪丸生精功能及p63在曲細(xì)精管的表達(dá)研究，旨在探討AR敲除對(duì)小鼠生殖功能及睪丸發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性Flox-AR小鼠，由美國(guó)羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心張傳祥教授實(shí)驗(yàn)室提供[6]；雌性ACTB-Cre小鼠，由美國(guó)JAX實(shí)驗(yàn)室提供。小鼠抗人p63單克隆抗體、S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 方法

按Flox-AR小鼠與ACTB-Cre小鼠交配。采用Cre-lox法[7]敲除胚胎中小鼠AR。取子代小鼠尾巴組織標(biāo)本，通過(guò)PCR檢測(cè)基因型，選擇AR敲除的雄性小鼠10只作為AR敲除組，AR未敲除雄性小鼠10只作為對(duì)照組。至10周齡稱重后以5%CO處死，均取右側(cè)睪丸，4%中性甲醛液固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切4 μm薄片，脫蠟，水化，采用p63鼠單克隆抗體以S-P免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行組織p63染色，操作均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。DAB顯色，沖洗，蘇木精復(fù)染，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。置于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察，p63主要定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核呈棕黃色則為p63陽(yáng)性。隨機(jī)選取視野內(nèi)10個(gè)睪丸曲細(xì)精管斷面，觀察p63表達(dá)，測(cè)定曲細(xì)精管內(nèi)徑、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)目、管周膜厚度、生殖細(xì)胞成熟度。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

睪丸生精功能采用Makler評(píng)分法[8]測(cè)定，曲細(xì)精管內(nèi)徑、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)目、管周膜厚度、生殖細(xì)胞成熟度，每項(xiàng)分為0～5分，滿分20分，得分越高功能越正常。p63表達(dá)強(qiáng)度采用半定量的免疫組織化學(xué)積分法（HSCORE）[5]，公式：HSCORE=∑Pi（i+1）。染色強(qiáng)度的主觀評(píng)估（i）由無(wú)染色至強(qiáng)染色分為0～3分，Pi為每個(gè)細(xì)胞中的強(qiáng)度百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組睪丸生精功能比較

兩組小鼠曲細(xì)精管內(nèi)徑、管周膜厚度、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)、生殖細(xì)胞成熟度評(píng)分及總Makler評(píng)分之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），AR敲除組睪丸生精功能顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)表1。

表1 兩組睪丸生精功能及p63表達(dá)的比較（x±s）

2.2 p63在小鼠睪丸曲細(xì)精管中的表達(dá)

p63的陽(yáng)性表達(dá)主要位于精原細(xì)胞及精母細(xì)胞，精子細(xì)胞及成熟精子中表達(dá)呈陰性，且AR敲除組表達(dá)陽(yáng)性率及HSCRE評(píng)分均顯著低于對(duì)照組（P < 0.01），見(jiàn)表1；AR敲除組p63表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)圖1、2。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，p63的表達(dá)強(qiáng)度與Makler評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.88，P < 0.01）。

3 討論

AR存在于睪丸的支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、管周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)睪丸結(jié)構(gòu)及功能的發(fā)育，而支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、管周細(xì)胞等的發(fā)育依賴雄激素及AR的表達(dá)，AR表達(dá)缺陷則可能造成睪丸各組織結(jié)構(gòu)發(fā)育不全。本研究采用雄性Flox-AR小鼠與雌性ACTB-Cre小鼠交配，從而使子代雄性小鼠所有細(xì)胞表達(dá)Cre，并能通過(guò)Cre-lox法敲除胚胎中的AR，建立AR敲除的小鼠模型，經(jīng)PCR檢測(cè)基因型確認(rèn)模型成功建立。取AR敲除組小鼠睪丸組織樣本鏡檢結(jié)果顯示，小鼠的曲細(xì)精管內(nèi)徑、管周膜厚度、管壁生殖細(xì)胞層數(shù)、生殖細(xì)胞成熟度與未敲除AR的對(duì)照組相比，存在顯著差異。AR表達(dá)缺陷的小鼠曲細(xì)精管內(nèi)徑變細(xì)，管周膜厚度增加，管壁生殖細(xì)胞層數(shù)減少，生殖細(xì)胞成熟度低。通過(guò)Makler評(píng)分法評(píng)估，其睪丸生精功能顯著低于對(duì)照組，由于AR的表達(dá)在生精周期第Ⅱ～Ⅶ期表達(dá)逐漸增強(qiáng)，第Ⅷ期后減弱，而在Ⅺ期出現(xiàn)特異性表達(dá)，表明其表達(dá)強(qiáng)弱與生精周期密切相關(guān)，參與精子生成的調(diào)控[9，10]，因此AR缺陷使小鼠曲細(xì)精管及生精細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)育出現(xiàn)顯著異常，生精周期出現(xiàn)功能紊亂影響雄性小鼠的精子生成。

p63缺失的小鼠可能出現(xiàn)頭頸部表皮和肢端的發(fā)育畸形，前列腺、乳腺及尿道上皮的發(fā)育缺陷[11，12]。本研究對(duì)小鼠曲細(xì)精管中的p63表達(dá)進(jìn)行分析，在小鼠曲細(xì)精管組織中p63表達(dá)主要位于精原細(xì)胞及精母細(xì)胞細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，AR表達(dá)正常的對(duì)照組小鼠曲細(xì)精管組織中p63表達(dá)強(qiáng)度很高，p63陽(yáng)性細(xì)胞為（82.73±5.44）%，而AR敲除組p63陽(yáng)性率僅為（67.38±2.93）%，半定量的HSCORE評(píng)分亦顯示AR敲除組表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明在胚胎期敲除AR導(dǎo)致小鼠生殖系統(tǒng)上皮及腺體內(nèi)p63的表達(dá)降低。并且p63的表達(dá)與Makler評(píng)分呈正相關(guān)，說(shuō)明p63低表達(dá)與曲細(xì)精管的生精能力下降有關(guān)。AR敲除組小鼠曲細(xì)精管細(xì)胞的分化存在顯著的缺陷，導(dǎo)致生殖細(xì)胞的成熟障礙，而p63表達(dá)強(qiáng)度弱，提示AR缺陷不僅使雄激素作用減弱，靶細(xì)胞和組織發(fā)育缺陷，AR可能對(duì)p63在曲細(xì)精管中的表達(dá)有調(diào)控作用，甚至同時(shí)對(duì)多種睪丸組織結(jié)構(gòu)的p63產(chǎn)生影響而導(dǎo)致發(fā)育缺陷，仍有待進(jìn)一步研究。由此可推測(cè)p63可能使AR介導(dǎo)雄性生殖器發(fā)育的途徑之一，AR被敲除的情況，p63表達(dá)下調(diào)可能是造成阻礙曲細(xì)精管生精上皮發(fā)育缺陷的直接作用因素，由于p63的染色主要位于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，而精子細(xì)胞及成熟精子中未見(jiàn)陽(yáng)性[13-15]，因此提示敲除AR導(dǎo)致的p63缺陷對(duì)小鼠曲細(xì)精管生精上皮的發(fā)育的影響主要集中在早期分化階段。

綜上所述，AR敲除小鼠睪丸曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)發(fā)育障礙，生精上皮的生精功能缺損。AR缺陷下調(diào)了p63在曲細(xì)精管生精上皮中的表達(dá)，從而使生精上皮分化障礙，導(dǎo)致精子早期分化階段發(fā)育缺陷影響雄性小鼠的生育能力。

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（收稿日期：2013-05-31）