皖南黑豬H—FABP基因5"—上游區和第二內含子的多態性分析及克隆測序

張陳華+張似青+杜波+滑志民+鄭江平+殷宗俊

摘 要：對皖南黑豬心臟脂肪酸結合蛋白（H-FABP）基因5-上游區和第二內含子的多態性進行分析及克隆測序，為開展皖南黑豬肉質性狀分子育種奠定理論基礎。采用PCR-RFLP（HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3種限制性內切酶）分子標記技術，分析了184頭皖南黑豬H-FABP基因5-上游區和第二內含子區的遺傳變異情況，并對該基因的多態片段進行克隆和測序分析。結果顯示：（1）在5-上游區，HinfⅠ位點上存在多態性，等位基因H的基因頻率為0.62，表現為中度多態（PIC=0.359 6）；在第二內含子區，HaeⅢ位點上存在多態性，等位基因D的基因頻率為0.92，表現為低度多態（PIC=0.130 7）；而MspⅠ位點上尚未檢測到多態，基因型均為AA型；HinfⅠ*位點上也存在多態性，等位基因B的基因頻率為0.78，表現為中度多態（PIC= 0.282 4）；（2）χ2檢驗表明，除5-上游區HinfⅠ多態位點外，其他3個位點均達到Hardy-Weinberg平衡狀態（P>0.05）；（3）對H-FABP基因3個多態片段進行克隆測序分析發現，HinfⅠ-RFLP是由于1 324 bp處存在T→C的突變引起，HaeⅢ-RFLP是由于1811bp處存在C→G的突變引起，HinfⅠ*-RFLP是由于1 970 bp處存在C→T的突變引起。本試驗確證了皖南黑豬H-FABP基因5-上游區的多態位點并在第二內含子區檢測到了HaeⅢ和Hinf*Ⅰ多態位點，這可為進一步分析H-FABP基因不同基因型與IMF含量的關系，以及確定影響IMF沉積的主效基因提供一定的數據基礎。

關鍵詞：皖南黑豬；H-FABP基因；IMF含量；PCR-RFLP；克隆測序

中圖分類號：S828 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.01.007

Sequence and Polymorphism Analysis of Wannan Black Pig H-FABP Gene 5-Upstream Region and the Second Intron

ZHANG Chen-hua1， ZHANG Si-qing1， DU Bo1， HUA Zhi-min1， ZHENG Jiang-ping1， YIN Zong-jun2

（1.Shanghai Vocational College of Agriculture and Forestry， Shanghai 201699， China；2. College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei，Anhui 230036， China）

Abstract： This paper analyzed， cloned and sequenced the polymorphism of H-FABP gene 5-upstream region and second intron to provide theoretical basis for the breeding of pork quality traits in Wannan Black Pig. The molecular marker techniques of PCR-RFLP （HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ3 kinds of restriction enzymes）was used， and the genetic variation of H-FABP gene 5'-upstream region and second intron in 184 Wannan Black Pigs was analyzed， moreover， the corresponding polymorphic fragments was cloned and sequenced. The results showed that： （1） there was polymorphism in loci of the Hinf in 5'-upstream region， and the frequency of allele H was 0.62， showing moderate polymorphism （PIC = 0.359 6）； there was polymorphism in polymorphic loci HaeⅢ in the second intron allele the frequency of D was 0.92， showing low polymorphism （PIC = 0.130 7 ）. While there was no polymorphism detected in the loci of MspⅠ， which genotype was AA genotype. polymorphism of Loci of HinfⅠ* was also existed， the frequency of allele B was 0.78， showing moderate polymorphism （PIC = 0.282 4）； （2） Chi-square test showed that 3 polymorphic sites had reached the equilibrium of Hardy-Weinberg （P>0.05）except the polymorphic site of HinfⅠin the H-FABP gene 5'-upstream region. （3） by cloning and sequence analysising three polymorphic fragments in H-FABP gene， we found that HinfⅠ-RFLP was due to T→C mutation in 1 324 bp， HaeⅢ-RFLP was due to C→G mutation in 1 811 bp and HinfⅠ*- RFLP was due to C→T mutation in 1 970 bp. The polymorphic loci of H-FABP gene in 5-upstream region of Wannan Black Pig was validated， and HaeⅢ and Hinf*Ⅰpolymorphic loci were detected in the second intron. The results provided certain data basis to determine the main effect gene that infect intramuscular fat （IMF） deposition for further investigating the relationship between different genotypes in H-FABP gene and variation in IMF content， whether H-FABP locus was the major gene for IMF deposition.

Key words： Wannan Black Pig； H-FABP gene； IMF content； PCR-RFLP； cloning and sequencing

收稿日期：2013-10-21；修訂日期：2013-11-13

基金項目：教育部科學技術研究重點項目（208059）；安徽省教育廳自然科學基金重點項目（KJ2009A114）；上海農林職業技術學院校內科研項目（091327）

作者簡介：張陳華（1985—），男，福建南平人，助教，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。

通訊作者簡介：殷宗俊（1967—），男，安徽合肥人，教授，博士，主要從事動物遺傳育種研究。

肌內脂肪（Intramuscular fat，簡稱IMF）含量，與肉質成正相關，影響肉質的風味、多汁性和嫩度，特別是嫩度。該性狀屬于數量性狀，遺傳基礎受多基因控制，存在主基因效應[1]。常規育種技術在提高瘦肉率和生長速度等方面的同時，伴隨著脂肪的減少，而且沉積在肌肉內的脂肪也同時減少，從而導致豬肉品質下降。一般認為2%～3%的IMF含量可產生理想的口感，但目前對瘦肉率的選擇已經使豬肉中平均IMF含量下降至1%～1.5%，低于理想的范圍[2]。據報道，IMF含量具有較高的遺傳力（0.6），而與背膘厚間存在中等偏低的不利遺傳相關（0.3）[3-4]。因此，可以對IMF含量進行遺傳改良，進而有效地改善豬肉品質。心臟脂肪酸結合蛋白（Heart fatty acid-binding protein， H-FABP）是FABP家族的一員，是一種低分子量（15 Kda）的胞漿蛋白，由H-FABP基因編碼，參與細胞內脂肪酸的運輸，主要功能是將脂肪酸從細胞膜運送到β-氧化和三酰甘油及磷脂合成部位[5]。H-FABP在胞內與脂肪酸結合，使細胞內外脂肪酸保持一定的濃度差，促進脂肪酸的攝取，進而影響脂肪的沉積[6]。Gerbens等[7-10]通過與人類H-FABP cDNA 噬菌斑雜交分離出含豬H-FABP 基因的λ噬菌體，確定豬H-FABP基因的結構特征并將其定位在豬6號染色體SW316-S0003（16.6 cM）之間，該基因由1.6 kb的上游調控區域、0.2 kb的3-端非轉錄區、4個外顯子和3個內含子組成。其中4個外顯子分別編碼24，58，34，17個氨基酸，3個內含子的大小分別為4.2，2.5，1.5 kb，該基因主要在心肌、骨骼肌和乳腺中表達[11]。Gerbens研究發現，H-FABP基因在杜洛克豬中存在HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ3個酶切多態位點，并認為H-FABP基因多態性可作為IMF含量的侯選基因。隨后又以153頭梅山豬的雜交后代作為供試群體，測定了H-FABP基因的多態性、mRNA、蛋白質的表達水平和背最長肌上的IMF含量。結果表明，在HaeⅢ多態位點基因型之間，IMF含量的遺傳變異與蛋白質的表達水平無關，而在mRNA水平上存在著顯著的差異，H-FABP基因的mRNA與IMF含量顯著相關。鑒于前人的研究結果，本試驗選取IMF含量較高的安徽省地方優良品種豬即皖南黑豬為試驗群體，采用PCR-RFLP方法檢測皖南黑豬H-FABP基因5-上游區和第二內含子區不同位點的多態性及檢測突變位點的基因型，并對該基因的多態片段進行克隆和測序分析。通過對皖南黑豬H-FABP基因5-上游區和第二內含子區變異位點的確切位置及引起變異的原因分析，旨在為繼續研究該基因的不同區域以確定影響IMF沉積的主效基因，及為皖南黑豬的種質資源特性與MAS研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 耳樣 試驗豬為184頭（均來安徽豐潤生態農業開發有限公司），用耳號鉗剪一小塊耳組織（約0.5 g），放入盛有1 mL 70%乙醇的1.5 mL Ep管中，采集的樣品-20 ℃保存。

1.1.2 試劑 蛋白酶K、Premix Tag （Version 2.0）購自大連寶生物工程（大連）有限公司，內切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 參照文獻[12]按常規方法進行基因組DNA的提取，將干燥后的DNA溶于100 μL的TE中，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取物的質量。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 根據GenBank上注冊的X98558、Y16180序列，在5-上游區和第二內含子區用Primer 5.0設計2對引物。引物序列見表1，該引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

PCR擴增體系組分（25 μL）：其中Premix Tag （Version 2.0）12.5 μL，模板DNA 2 μL，上下引物（20 μΜ）各1 μL，滅菌蒸餾水8.5 μL。

PCR擴增條件：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 45 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃2 min，共33個循環；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.3 PCR擴增產物的酶切 以HinfⅠ酶切PCR1擴增產物，以HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ分別酶切PCR2的擴增產物。酶切體系20 μL，其中，PCR產物6 μL，10×Buffer 2 μL，限制性內切酶1 μL，37 ℃反應4 h，酶切產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 H-FABP基因 PCR-RFLP片段克隆測序 通過PCR-RFLP分析，將HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ酶切片段中具有多態性的不同基因型的PCR擴增產物經純化后送交上海生物工程技術服務有限公司測序。

1.3 統計分析方法

1.3.1 基因頻率和基因型頻率的計算 其計算公式為：

Pi=（2（ii）+（ij1）+（ij2）+…+（ijn-1）+（ijn））/2

式中，Pi為第i個等位基因的頻率；i為純合復等位基因；ii為第i個等位基因純合的個體數；jn為與i共顯的第n個等位基因；ijn為含有i與jn共顯性等位基因的個體數；n為1個群體內個體的總數。由于PCR-RFLP方法的檢測結果為共顯性等位基因，因此，表型頻率即為基因型頻率。基因型頻率=基因型個體數/測定群體總數。

1.3.2 基因頻率和基因型頻率的差異顯著性檢驗（χ2獨立性檢驗） 首先根據基因頻率計算各種基因型頻率的理論值，然后計算χ2。因為本研究資料的自由度df=1，當基因型理論值小于5時，可采用矯正公式：

x2=■■

式中，Ei為理論值，Oi為實際觀察值，n為等位基因數。

2.3.3 H-FABP基因的純合度、雜合度、有效等位基因數和多態信息含量的計算 純合度公式：

H0=■P■■

式中，Ho為某一位點的純合度，Pi為第i個等位基因的頻率，n為等位基因數。

雜合度計算公式：

He=1-H0 =1-■P■■

式中，He為某一位點的雜合度，Pi為某一位點上第i個等位基因頻率，n為某一位點的等位基因數。

有效等位基因數計算公式為：

Ne=1/H0

多態信息含量（polymorphism information content ，PIC）是由Bostein等提出的用于度量群體多態程度的指標，一個標記在群體中的PIC值是根據其等位基因的頻率來計算的，其公式：

PIC=1-■P■■-■■2P■■P■■

式中，n為等位基因數目；Pi和Pj分別為第i和第j個等位基因在群體中的頻率。PIC值用于對標記基因多態性的估計，PIC>0.5為高度多態，PIC<0.25為低度多態，0.25

2 結果與分析

2.1 皖南黑豬H-FABP基因PCR產物的擴增結果

擴增PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1、圖2。PCR擴增產物檢測結果顯示，擴增片段與目的片段大小一致且特異性較好，可直接進行PCR-RFLP。

2.2 皖南黑豬H-FABP基因PCR-RFLP結果

據GenBank X98558、GenBank Y16180序列可知，H-FABP基因PCR擴增片段長度分別為693，816 bp。在PCR1（693 bp）擴增片段上存在4個HinfⅠ酶切位點，產生339，172，98，59，25 bp 5個片段，其中1 324 bp處為多態性酶切位點，當此酶切位點消失時，172 bp和59 bp片段合并產生231 bp的片段；在PCR2（816 bp）擴增片段上：存在3個HaeⅢ酶切位點，產生405，278，117，16 bp 4 個片段，其中1 811 bp處為多態性酶切位點，當此酶切位點消失時，278 bp和405 bp片段合并產生683 bp的片段；存在1個MspⅠ酶切位點，產生750，66 bp 2個片段，其中在l 878 bp處為多態性酶切位點，當此酶切位點消失時750 bp和66 bp片段合并產生816 bp的片段；存在3個HinfⅠ*酶切位點，產生521，217，47，32 bp 4個片段，其中1 970 bp處為多態性酶切位點，當此酶切位點消失時，217 bp和47 bp片段合并產生264 bp的片段。本試驗部分個體H-FABP基因酶切結果見圖3～6。

2.3 皖南黑豬群體遺傳學分析

對皖南黑豬群體H-FABP基因3個多態酶切位點進行基因型檢測，并計算其基因型頻率、基因頻率及Ho He、Ne、PIC值等，其結果見表2～4。

由表2可知：在皖南黑豬群體中，基因型HH、DD、AA、BB占很大優勢，等位基因H、D、A、B分布頻率也遠高于h、d、a、b。而在MspⅠ位點上尚未檢測到多態性，僅發現AA基因型，且在HaeⅢ位點上，只檢測到DD、Dd兩種基因型尚未發現dd基因型，說明了試驗豬群H-FABP基因在這兩位點遺傳品質的純合度較高；本試驗在5-上游區和第二內含子區均檢測到HinfⅠ多態位點。

由表3可知：經χ2適合性檢驗表明：除5-上游區HinfⅠ多態位點外，其他3個位點的基因頻率和基因型頻率均達到Hardy-Weinberg平衡狀態（P>0.05），說明該群體在適應性方面具有遺傳優勢，并經過長期進化和選擇達到了平衡狀態。而導致HinfⅠ多態位點未達到Hardy-Weinberg平衡的原因可能是由于皖南黑豬在實驗動物化培育過程中無意間進行了某些人工選擇所致。

從表4可以知：693 bp、816 bp的H-FABP基因片段被HinfⅠ酶切后均表現多態，兩位點Ho分別為0.529 9，0.659 7，He分別為0.470 1，0.340 3，

Ne分別為1.887 1，1.515 8，PIC分別為0.359 6，

0.282 4，均屬中度多態。因此，該試驗結果在一定程度上可作為有效的遺傳標記用于該群體遺傳資源評價的建議性指標；HaeⅢ位點上，Ho為0.859 4，He為0.140 6，Ne為1.163 6，PIC為0.130 7，屬低度多態；由于MspⅠ位點未檢測到多態，因此其Ho為1，He為0，Ne為1，PIC為0。導致HaeⅢ、MspⅠ這兩位點結果的原因可能是：（1）本試驗豬群處在一個封閉的環境中，較少有外界其他豬種血緣的進入，并通過長期的群體內部自然近交，使得有利基因不斷純化，同時也使一些等位基因發生了丟失，從而導致其PIC的降低；（2）這兩個基因座比較保守；（3）本試驗樣本量較小所致。

2.4 皖南黑豬H-FABP基因測序結果

將測序結果與豬H-FABP基因DNA序列（GenBank，登錄號為X98558、Y16180）進行比對，結果顯示：在5-上游區，所擴增的693 bp的片段1 324 bp處發生T—C突變，從而形成兩個等位基因H和h（圖7）；在第二內含子，所擴增的816 bp的片段1 811 bp處發生G—C突變，從而形成兩個等位基因D和d（圖8）；而在1 489 bp處尚未發現多態突變位點，其測序結果如圖9所示；在1 970 bp處發生C—T突變，從而形成兩個等位基因B和b（圖10）。

3 討 論

Gerbens等[8-9]利用限制性內切酶HinfⅠ、HaeⅢ和MspⅠ對荷蘭長白豬、杜洛克、大白、漢普夏、梅山、皮特蘭和野豬的H-FABP基因5-上游區和第二內含子區進行PCR-RFLP檢測發現，除梅山豬和漢普夏豬未檢測到HaeⅢ和MspⅠ多態位點外，其他豬種均檢測到3個酶切多態位點。龐衛軍等[13]的研究表明在HaeⅢ和MspⅠ多態位點上，所檢測的榮昌豬、內江豬和八眉豬在這兩位點上均無多態性，并認為中國地方品種豬在這兩位點上多態型缺乏，地方品種內IMF的差異主要是由于5-上游區HinfI多態位點的不同基因型所致。張桂香等[14]通過研究發現，北京黑豬、二花臉豬、金華豬、小梅山豬、皖南花豬、滇南小耳豬、香豬、榮昌豬和大白豬中均存在一個HinfⅠ多態位點，且均未發現MspⅠ多態位點，而HaeⅢ多態位點僅出現在皖南花豬和大白豬中，該研究首次報道了在皖南花豬H-FABP基因第二內含子區中存在Hinf*多態位點。本試驗在皖南黑豬中驗證了H-FABP基因5-上游區HinfⅠ和第二內含子區HaeⅢ多態位點，而在第二內含子區尚未發現MspⅠ多態位點。另外，本試驗還在第二內含子區中檢測到了Hinf*Ⅰ多態位點。該結果與張桂香的報道的研究結果基本一致。在HaeⅢ位點的檢測結果中，本試驗豬群與中國其他地方品種豬的檢測結果有一定的差異，而與張桂香檢測的皖南花豬基本一致，產生這一結果可能原因是：（1）皖南花豬和皖南黑豬主要分布于皖南山區，其地理位置、氣候條件和生長環境相近，進而使得這兩個地方品種豬的檢測結果一致；（2）由于研究群體的遺傳背景不同所致；（3）與本研究所選用的群體規模較小有關。本試驗只發現兩種基因型DD、Dd尚未發現基因型dd，是否存在另外一種基因型尚需進一步擴大試驗規模進行驗證。

國內外研究表明：在豬H-FABP基因中，3種內切酶（HinfⅠ， HaeⅢ， MspⅠ）所檢測的每一種PCR-RFLP，其純合基因型間IMF含量差異顯著，且aaddHH型（MspⅠ-a， HaeⅢ-d， HinfⅠ-H） 具有最高的IMF含量[8-9，13]。國外品種豬肉的IMF含量較低，為2%左右，只有杜洛克豬的IMF含量相對較高。我國地方豬種的IMF含量一般處于中等到豐富的水平之間（3%～7%）[15]。本試驗結果發現，皖南黑豬H-FABP基因在5-上游區Hinf I-位點上表現出豐富多態性。HinfI多態位點位于5-上游區域，可能由于該區域的變異影響H-FABP基因的表達，進而影響IMF的含量[9-10]。另外，4個位點的基因頻率A、D、H和B占有明顯優勢，這一試驗結果也可能與皖南黑豬作為脂肪型豬IMF含量較高有關。

H-FABP基因位于6號染色體上，其可能的連鎖順序為：S0035-[11.7]-SW2406-[29.9]-SW1057-[29.6]- S0220-[12.7]-SW316-[5.1]-HABP-[11.5]-S0003-[51.3]- SW2419[9]，這一染色體區域被認為是影響脂肪性狀的QTL區域。在該染色體上還定位了激素敏感脂肪酶基因（HSL）[16]、磷酸葡萄糖脫氫酶基因（PGD）[17]等基因，這兩個基因多態性與豬的背膘厚、眼肌面積顯著相關[18-19]。此外，豬瘦素受體基因（LEPR）也定位于該染色體上，該基因可能是影響脂肪性狀的一個潛在的候選基因[20]。上述幾個基因間是否存在連鎖及相互之間的關系如何目前尚不清楚。因此，需聯合更多相關的候選基因或DNA 標記來進行分析，尋求與IMF沉積緊密連鎖的遺傳標記，并進一步確定H-FABP不同基因型與IMF 的關系，以便在動物育種實踐的標記輔助選擇（MAS） 中發揮遺傳改良的作用。另外，值得注意的是H-FABP本身是牛、鼠、人培養乳腺上皮細胞的生長抑制因子[21]，H-FABP的變異情況是否是造成皖南黑豬體型小，生長緩慢的原因之一尚有待研究。

4 結 論

本試驗通過對皖南黑豬H-FABP基因5-上游區和第二內含子區變異位點的確切位置及引起變異原因的分析，確定了4個變異酶切位點的位置和突變的堿基序列。這為進一步開展皖南黑豬肉質性狀分子育種提供了基礎數據，并為繼續研究該基因的不同區域，尋找更多的多態性及確定影響IMF沉積的主效基因奠定理論基礎。

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