大菱鲆免疫球蛋白M(IgM)單克隆抗體的制備與特性鑒定

王蔚芳，李青梅，柴書軍，甘玲玲，洪 磊，郭軍慶，雷霽霖

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東青島266071；

2.河南省農業科學院，河南省動物免疫學重點實驗室，鄭州450002；3.四川省富順縣水產漁政局，四川富順643200）

1 前言

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是20世紀90年代由歐洲引進我國的名貴魚種，在突破繁育、創建“溫室大棚+深井海水”養殖模式的基礎上，如今歷經20年風雨的大菱鲆養殖產業已經展現出強大的生命力和發展潛力，并成為我國工廠化養殖的樣板工程，帶動了沿海其他養殖魚類產業的提升與轉型。然而在其工業化發展進程中，循環水、高密度的養殖模式對疾病防控技術的要求亟待提升。在當前日益增長的環保理念和食品安全意識的要求下，以疫苗等為主要代表的免疫病害防控技術受到重視，通過免疫防控途徑能有效增強魚體主動防御能力，減少疾病的發生概率[1]。然而對大菱鲆免疫學的研究報道有限，Kofod等[2]分離純化了大菱鲆免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM），Estévez等[3]制備了大菱鲆免疫球蛋白單克隆抗體，王賢麗等[4]從大菱鲆脾臟cDNA文庫中篩選得到了免疫球蛋白L輕鏈的全長cDNA片段，馮守明等[5]對大菱鲆免疫相關組織中免疫球蛋白陽性細胞進行了檢測，丁冰潔等[6]首次得到了大菱鲆多聚免疫球蛋白受體完整的cDNA序列。未見大菱鲆IgM單克隆抗體相關研制和應用的報道。

單克隆抗體具有均一性、高效性、特異性、生物活性單一性及可無限供應等特點，將單克隆抗體技術應用于大菱鲆免疫球蛋白結構和功能分析、病原和抗體檢測、疫苗研制及免疫應答規律研究等方面具有科學理論意義和生產應用價值。因此，本研究將純化的大菱鲆IgM免疫BALB/C小鼠，利用細胞工程技術生產融合的雜交瘤細胞，篩選分泌大菱鲆IgM的單克隆抗體雜交瘤細胞，制備并生產大菱鲆IgM單克隆抗體。

2 材料與方法

2.1 免疫原制備

純化的大菱鲆血清IgM由本實驗室制備并保存[7]。將純化的大菱鲆IgM分別與等體積的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（Pierce，USA）混勻乳化后免疫小鼠。

2.2 免疫動物

選用6周齡BALB/C雌性小鼠進行免疫，免疫程序見表1。

表1 免疫程序Table 1 The immunization schedule

2.3 飼養細胞制備

脫頸椎處死正常BALB/C小鼠，無菌條件下剪開腹部皮毛，用注射器吸取5m LRPM I-1640培養基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷溶液）后注射到小鼠腹膜內，同時輕壓小鼠腹腔，然后將培養基吸入注射器內并移出；將吸出的腹腔液轉移到24孔細胞培養板中，放入二氧化碳培養箱中培養，待用。

2.4 細胞融合

1）脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟，過100目篩網后用GNK（葡萄糖、NaCl、KCl、酚紅及磷酸鹽）溶液洗滌2次，然后溶于10m LGNK溶液，吹打形成單細胞懸液。

2）取105個處于對數生長期的NS0骨髓瘤細胞（由英國國家動物健康研究院惠贈），1 000 r/m in，離心10 min，棄上清液，用40m L GNK溶液重懸沉淀物。

3）將脾細胞懸液和骨髓瘤細胞懸液混合均勻后，1 000 r/m in，離心10m in，完全吸除上清液，輕彈離心管底，打散細胞，放入37℃水浴中；加入37℃預熱好的聚乙二醇溶液1m L，在1m in內滴加完，然后在37℃水浴中緩慢轉動90 s。

4）加入已經預熱到37℃的GNK溶液15m L（開始緩慢滴加，后來逐漸加快速度），然后繼續緩慢滴加GNK溶液至40m L，并在37℃水浴中靜置5m in。

5）1 000 r/m in，離心10m in，用預熱好的RPM I-1640培養基（含10%新生牛血清和1%次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液）稀釋沉淀的細胞，然后加到96孔含飼養細胞的細胞培養板中。

6）將培養板放入二氧化碳培養箱（二氧化碳5%，37℃）中培養，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，大概5～7天后進行換液，吸出100μL培養液，更換等量含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷溶液的培養液。

2.5 陽性雜交瘤細胞株的篩選

細胞融合后10天左右，觀察細胞生長狀態良好并開始檢測篩選，將篩選的陽性雜交瘤細胞轉移到24孔細胞培養板中進行擴大培養。酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法檢測篩選步驟如下：以0.05mol/L（pH=9.6）碳酸鹽溶液稀釋大菱鲆免疫球蛋白至2μg/m L，取50μL稀釋液加入酶標板孔中，置于4℃冰箱中過夜包被，次日以0.01mol/L（pH=7.4）磷酸鹽-吐溫溶液（PBST，0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3m in；用5%豬血清于37℃封閉1 h，封閉結束后以PBST同法洗滌；加入雜交瘤細胞培養上清，每孔加入50μL，陰性對照為細胞培養基，陽性對照為免疫小鼠血清，于37℃反應15min后以PBST同法洗滌；然后每孔加入50μL羊抗鼠IgGHRP（1∶1 000稀釋），于37℃ 反應30m in后洗滌；每孔加入新配制的50μL顯色液TMB（四甲基聯苯胺）顯色5m in后，加入2mol/L硫酸溶液50μL終止反應；結果判定用自動酶標儀讀取OD450值（P/N≥2.1時判定為陽性）。

2.6 陽性雜交瘤細胞系的建立與克隆

采用有限稀釋法對篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克?。涸?6孔細胞培養板各孔中加入100μL的飼養細胞；然后把要克隆的陽性雜交瘤細胞孔中的細胞用血球計數板進行計數，用培養液以10倍梯度進行稀釋，取出100個雜交瘤細胞；將取出的雜交瘤細胞混勻后，滴加到鋪滿飼養細胞的96孔板中，每孔加入100μL，平均每孔含有一個雜交瘤細胞；然后放入二氧化碳培養箱中培養。期間，定期觀察細胞生長狀況并記錄，并通過上述ELISA法檢測各培養孔的上清液（確保陽性率100%），把所得陽性克隆孔的雜交瘤細胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。

2.7 腹水制備（單抗大量生產）

1）小鼠預處理：在接種雜交瘤細胞前1周，用0.5m L液體石蠟腹腔注射正常BALB/C小鼠。

2）接種雜交瘤細胞：將培養的雜交瘤細胞離心，棄去上清，雜交瘤細胞用無血清培養液懸浮，并將細胞數調至106/m L，每只小鼠腹腔注射0.5m L。

3）采集腹水：接種雜交瘤細胞后約7～12天，小鼠腹部可見明顯膨大。用75%酒精棉球消毒腹部皮膚后，用注射器抽取腹水。每只小鼠抽取腹水2m L，間隔5天后，待腹水再生積聚后，同法抽取。

4）腹水處理：收集的腹水3 000 r/m in離心20min，收集上清，-20℃保存備用。

2.8 單抗特性鑒定

2.8.1 ELISA法測定單抗效價

以2μg/m L純化大菱鲆免疫球蛋白包被酶標板，每孔50μL，4℃過夜，封閉后加細胞上清液和腹水抗體，細胞上清液從1∶100倍比稀釋到1∶12 800，腹水從 1∶1 000倍比稀釋到 1∶2 048 000，每孔50μL，其余步驟同2.5節。

2.8.2 單抗靈敏度的測定

純化的大菱鲆IgM起始濃度為2μg/m L，倍比稀釋至2 ng/m L，每孔50μL，4℃過夜包被，封閉洗滌后滴加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節。

2.8.3 單抗Western blot分析

SDS-PAGE分離純化的大菱鲆免疫球蛋白（凝膠由10%分離膠和3%濃縮膠組成），將電泳凝膠轉印到硝酸纖維素膜（孔徑0.22μm）上，轉印完畢將硝酸纖維素膜用脫脂奶粉封閉1 h，PBST洗滌后將硝酸纖維素膜置于腹水稀釋液中（1∶250 000）緩慢搖動1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜置于羊抗鼠IgG-HRP（1∶500稀釋）緩慢搖動1 h，同法洗滌后，將硝酸纖維素膜放入HRP-DAB底物顯色液中，至顏色清晰為止，然后將硝酸纖維素膜用去離子水沖洗干凈后，置于濾紙間干燥，拍照記錄后暗處保存。

2.8.4 單抗特異性的測定

收集大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鰨、紅鰭東方鲀、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚、許氏平鲉、六線魚、鱸魚血清，待檢魚血清用包被液以1：100倍稀釋后包被于酶標板，每孔50μL，4℃過夜，封閉洗滌后加單抗（1∶25 000），每孔50μL，其余步驟同2.5節。

3 結果

3.1 單抗的篩選

采用上述免疫和細胞融合方法，用直接ELISA法對培養的雜交瘤細胞進行篩選，獲得4株陽性雜交瘤細胞，編號分別為B1D1、D5C2、E1B2、F4A1。雜交瘤細胞經過3次亞克隆篩選，保證100%的陽性率，經連續傳代培養后依然能夠穩定分泌抗體。

3.2 單抗特性鑒定

經直接ELISA法檢測，4株單抗的細胞培養上清效價為1∶1 280～1∶2 560，其中E1B2的細胞上清及腹水效價分別為1∶2 560和1∶1.024×106。

用不同濃度的大菱鲆IgM包被96孔板，ELISA法測定單抗E1B2的敏感性，結果表明E1B2腹水對大菱鲆IgM的檢測靈敏度為32 ng/m L。

應用SDS-PAGE技術，對獲得單抗進行Western blot分析，結果表明單抗能與大菱鲆IgM發生特異性結合，特異識別IgM重鏈區（見圖1）。

圖1 單抗的Western blot圖譜Fig.1 Western blot analysis of monoclonal antibody against IgM of turbot

3.3 單抗特異性測定

將單抗與不同種類的魚血清進行ELISA反應，結果表明單抗與大菱鲆血清呈強陽性反應，與褐牙鲆、紅鰭東方鲀、許氏平鲆、六線魚、鱸魚均呈微弱陽性反應，而與半滑舌鰨、鯉魚、鯽魚、草魚、鳙魚的血清無交叉反應（見圖2）。

圖2 ELISA法檢測單抗與各種魚血清的交叉反應Fig.2 The reaction of monoclonal antibody again stserum from eleven species of fish by ELISA

4 討論

單克隆抗體能夠特異性識別單一抗原決定簇，且經過多次克隆和篩選獲得，從而避免交叉反應帶來的假陽性，提高檢測的準確性，檢測靈敏度可達到納克水平，是免疫學和血清學研究的重要工具。魚類是具有細胞免疫和體液免疫系統的最低等的脊椎動物，已報道在魚類免疫系統中存在4種主要的免疫球蛋白（IgM、IgD、IgT和IgZ）[8]，其中IgM發現最早、研究最多。魚類免疫球蛋白的單抗不僅可以用于魚類免疫細胞的鑒定、發生和活性研究，也可用于監測病原感染或疫苗接種過程中的免疫應答反應，是魚類免疫機理和魚病免疫防治研究的有力工具。

在大菱鲆IgM單抗制備過程中，免疫原IgM的提純是關鍵的一步。通常免疫原越純，單抗效果越佳。在本研究中，大菱鲆IgM的提取和純化是建立在實驗室已經完成的相關工作基礎上進行的，獲得的IgM純度高，經SDS-PAGE檢驗，大菱鲆血清IgM有兩條帶，分子質量分別是76 kD和27 kD，代表免疫球蛋白的重鏈和輕鏈，條帶清晰，無雜帶[7]。在此基礎上，將其免疫小鼠，通過細胞融合及多次克隆和篩選，獲得了穩定分泌大菱鲆IgM的雜交瘤細胞株。生產的單抗效價高（1∶1.024×106）、檢測靈敏度高（32 ng/m L），有效保證其在大菱鲆相關免疫學研究中的應用。

本研究通過Western blot方法對制備單抗的特性鑒定分析表明，單抗能特異識別大菱鲆IgM的重鏈。在草魚、歐洲鰻、花鱸、南方鲇等魚血清IgM單抗研究中也發現，大部分單抗僅識別IgM重鏈[9～12]。這可能是由于IgM分子重鏈恒定區的氨基酸序列多、結構復雜，可提供多個抗原表位；而輕鏈相對簡單，其上免疫表位少，所以篩選到的強陽性細胞株大部分是抗重鏈的，而在篩選過程中抗輕鏈的雜交瘤細胞很容易被放棄和丟失。

在交叉實驗中，研制的單抗與半滑舌鰨及草魚、鯉魚、鳙魚、鯽魚4種淡水魚類的血清無交叉反應，與鱸魚、六線魚、許氏平鲉、紅鰭東方鲀、牙鲆五種海水魚類血清有微弱的交叉反應，而與大菱鲆的血清反應是最強烈的，表明該單抗具有較好的特異性。同時，也可以看出，不同魚類的免疫球蛋白存在特異性抗原位點，但也存在相同的抗原決定簇，這種共同的抗原決定簇會存在于親緣關系較近的品種之間。

5 結語

單克隆抗體技術在人類及畜牧業的疾病控制與預防中發揮著重要作用，是疾病的檢測、預防和治療的有力武器。單克隆抗體能夠在實驗室通過細胞培養而得到批量生產，在應用上具有專一性強、重復性好、操作簡便等優點，有較高的科研應用價值和生產實際應用前景。本研究制備的大菱鲆IgM單克隆抗體效價高、靈敏度高、特異性強，適合用于大菱鲆免疫學相關研究和生產實際應用。

[1] 甘玲玲，王蔚芳，雷霽霖，等.鲆鰈類漁用疫苗研究現狀及展望[J].漁業科學進展，2013，34(2)：125-131.

[2] Kofod H，Pedersen K，Larsen JL，et al.Purification and characterization of IgM-like immunoglobulin from turbot(Scophthalmus maximusL.)[J].Acta Veterinaria Scandinavica，1994，35(1)：1-10.

[3] Estévez J，Leiro J，Santamarina M T，et al.Monoclonalantibodies to turbot(Scophthalmus maximus)immunoglobulins：characterization and applicability in immunoassays[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，1994，41(3-4)：353-366.

[4] 王賢麗，張玉喜，孟 亮，等.大菱鲆免疫球蛋白輕鏈IgL全長cDNA的分離、鑒定及表達分析[J].中國海洋大學學報，2010，40(4)：31-37.

[5] 馮守明，繩秀珍，戰文斌.免疫球蛋白陽性細胞在大菱鲆免疫相關組織中的分布[J].武漢大學學報(理學版)，2008，54(6)：751-756.

[6] 丁冰潔，繩秀珍，唐小千，等.大菱鲆多聚免疫球蛋白受體基因的克隆及表達分析[J].中國水產科學，2013，20(4)：792-801.

[7] 王蔚芳，柴書軍，劉慶堂，等.大菱鲆疾病早期快速檢測方法——膠體金免疫層析試紙的研制與建立[J].中國工程科學，2012，14(2)：9-14.

[8] Warr GW.The immunoglobulins and the genes that encode them[J].Developmental&Comparative Immunology，1995，19：1-12.

[9] 郝貴杰，沈錦玉，徐 洋，等.草魚免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其特性鑒定[J].細胞與分子免疫學雜志，2009，25(9)：808-810.

[10] 林天龍，陳 強，龔 暉，等.歐洲鰻免疫球蛋白單克隆抗體的制備與特性[J].水產學報，2001，25(6)：532-598.

[11] 許娜娜，錢 冬，趙海泉.花鱸免疫球蛋白的分離純化及部分特性分析[J].中國水產科學，2011，18(1)：103-109.

[12] 張小萍，魏 靜，邱 艷.南方鲇免疫球蛋白單克隆抗體的制備及特性[J].水生生物學報，2012，36(3)：379-384.