不同紫云英基因型根系分泌物中有機酸成分分析

林新堅，蘭忠明，張輝，王飛，何春梅

（福建省農業科學院土壤肥料研究所 農業資源與環境研究中心，福建 福州350013）

低分子量有機酸是指相對分子質量＜500的含羧基化合物，是土壤中廣泛存在的一類非常活潑的物質。它們主要來源于土壤表層動植物殘體的分解、微生物的代謝作用、植物根系的分泌物和施入土壤有機物的轉化［1－3］。低分子量有機酸是植物根系分泌物中最為重要的成分，它們在養分活化、改變土壤微生物活性以及緩解金屬元素毒害脅迫方面發揮重要作用［4］。不少研究結果表明，許多植物的根系如白羽扇豆（Lupinusalbus）［5－8］、木豆（Cajanuscajan）［9－10］、大麥（Hordeumvulgare）［11］、菜豆（Phaseolusvulgaris）［12－13］等都能夠分泌大量的低分子量有機酸（檸檬酸、蘋果酸、草酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸等），這些低分子量有機酸能夠溶解部分難溶性磷，提高土壤磷素有效性進而促進植物活化吸收利用難溶性磷酸鹽的作用［14－16］。有研究表明，根系分泌有機酸的分泌量是植物本身的反應特征，受植物的種類、遺傳特性的影響。因而，不同作物品種有機酸分泌量存在很大差異，且同一作物種類不同基因型其有機酸分泌量也存在差異。有學者提出，提高磷有效性最有效的途徑，就是培育耐低磷及磷高效利用品種［17］。在低磷條件下，植物主要通過還原和絡合反應提高土壤中難溶性磷的生物有效性，有機酸的分泌也能活化土壤中的難溶性磷［18］，從而促進植物對磷的吸收。目前有用化學浸提法研究有機酸對幾種人工合成磷酸鹽（Ca2－P、Fe－P和Al－P）的活化作用，發現低分子質量有機酸對難溶性磷酸鹽的活化能力與有機酸種類、濃度有關，有機酸濃度增加，磷酸鹽溶解度增加，這主要是有機酸能與土壤中難溶性化合物中陽離子進行螯合反應，促進難溶性養分的溶解，從而釋放難溶性養分。目前國內對植物根系分泌物的研究，大多集中在水培和沙培研究，對在土培或原位條件下（能夠很大程度上反映田間條件下真實分泌情況）收集植物根系分泌物研究報道較少，因此本研究嘗試分析不同紫云英（Astragalussinicus）基因型在土培條件下根系分泌物中有機酸成分及差異。

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試紫云英品種有9個：1－閩紫1號，2－信陽種，3－閩紫7號（8324411），4－8487711，5－浙紫5－12，6－閩紫6號，7－余江大葉，8－84341022，9－弋江籽，3次重復。試驗于2011年11月1日播種，2012年2月8日收集根系分泌物并采收。紫云英種植在黑色塑料袋內，規格為直徑15cm，高度12cm。培養基質為土壤與蛭石混合，重量為1 kg，土壤與蛭石比重約6∶1，攪拌混勻裝袋。供試土壤為水稻土，其土壤本底養分分別為堿解氮117．3mg／kg，有效磷30．2mg／kg，速效鉀69．8mg／kg，pH 5．01，有機質18．0g／kg，全磷0．51g／kg。

1．2 根系有機酸收集

紫云英根系有機酸收集：采用抖土法將根系松散結合的土壤抖落，剩余的與根系緊密結合的土壤為根際土，把根與根際土一同浸入50mL去離子水塑料紙杯中，培養4h，取出根系，充分混勻土壤懸濁液，用定量濾紙202將根系分泌物溶液過濾到容積為50mL塑料瓶中，定容到40mL（即為紫云英根系分泌物），放置－20℃冷凍冰箱保存備用。清洗根部，用剪刀剪植株地上莖葉和根部，分別裝入信封，在105℃下殺青30min后，均勻穩定在75℃下，48h烘至恒重。

1．3 有機酸測定方法

土培條件下收集的紫云英根系分泌物上Waters2695高效液相色譜儀（HPLC）。樣品和標樣的前處理：用平頭注射器吸取1mL樣液，過0．45μm水相濾膜，等待進樣。流動相：0．04mol／L磷酸二氫鉀－磷酸緩沖溶液，pH為2．40。流速：1．0mL／min，進樣量：5μL，溫度：35℃，色譜柱：菲羅門柱，4．6mm×250mm，檢測器：二極管陣列檢測器Waters2996。有機酸標準樣品的配制：分別稱取草酸500mg，酒石酸500mg，蘋甲酸500mg，檸檬酸500mg，馬來酸500mg，琥珀酸20mg，這6種有機酸定容體積都為10mL；分別吸取甲酸、乳酸、乙酸各5mL，定容體積分別為25，50和50mL。混標1：上機濃度9種酸各自標準母液混合并稀釋10倍（標樣取100μL，用流動相定容到1mL），混標2：馬來酸稀釋1000倍，其余各酸標準溶液稀釋10倍（馬來酸取10μL，其余各酸取1mL，最后用流動相定容到10mL）。

1．4 數據處理

本文的結果數據為3次重復的平均值，數據進行ANOA方差分析，并用LSD進行多重比較。數據分析及圖表均在 Microsoft Excel 2003和 DPS 12．5軟件上進行。

2 結果與分析

2．1 不同紫云英基因型性狀及干物重差異

從表1可以看出，不同紫云英品種在土培條件下其株高、根長及干物重的差異表現為：閩紫6號，閩紫7號和8487711之間株高差異不顯著，但這3個品種顯著高于閩紫1號，信陽種，余江大葉和弋江籽；紫云英根部長度9個品種間差異不顯著，可能由于生長在小型容器范圍內限制了根系的生長。從紫云英地上部莖葉和地下根部干物質看，閩紫7號顯著高于閩紫1號，但與其他幾個品種間未見顯著差異。然而在總干重方面（地上部和地下部干重總和），閩紫7號顯著大于閩紫1號，余江大葉和弋江籽。

2．2 不同紫云英基因型根系分泌草酸、蘋果酸濃度差異

從圖1和圖2可見，不同紫云英基因型分泌的草酸和蘋果酸濃度分別介于0．015～0．034mg／mL和0．001～0．031mg／mL之間。9個紫云英品種都可分泌草酸，且重復間穩定變異系數不大；84341022（0．034mg／mL）分泌的草酸量最大，顯著高于閩紫1號、閩紫7號、8487711、浙紫5－12、余江大葉和弋江籽，但84341022與信陽種和閩紫6號之間差異不顯著。在蘋果酸分泌方面，除弋江籽未檢測到，其余8個品種都有一定量蘋果酸分泌；閩紫1號蘋果酸分泌量低，僅為0．001mg／mL，閩紫7號分泌量最大達到0．031mg／mL；閩紫7號和浙紫5－12這2個品種蘋果酸分泌量顯著高于閩紫1號，但除閩紫1號外，其他品種間未見顯著差異，究其原因可能與重復間變動差異大有關。

2．3 不同紫云英基因型根系分泌乳酸、乙酸濃度差異

從圖3可見，紫云英乳酸分泌量介于0．027～0．530mg／mL，閩紫7號和浙紫5－12乳酸分泌量大，分別為0．53和0．52mg／mL；但經過方差分析表明，9個品種間乳酸分泌未見顯著差異，其原因是重復間變動差異大所致。從圖4可以看出，乙酸分泌量為0．01～0．14mg／mL，閩紫1號和閩紫7號顯著高于閩紫6號、余江大葉、84341022和弋江籽，但閩紫1號、信陽種、閩紫7號和8487711品種間乙酸分泌未見顯著差異。

表1 不同紫云英基因型性狀及干物重差異Table 1 Effect of genotypic character of different A．sinicus on dry weight

圖1 不同紫云英基因型草酸濃度差異Fig．1 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on oxalic acid

圖2 不同紫云英基因型蘋果酸濃度差異Fig．2 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on malic acid

圖3 不同紫云英基因型乳酸濃度差異Fig．3 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on lactic acid

圖4 不同紫云英基因型乙酸濃度差異Fig．4 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on macetic acid

2．4 不同紫云英基因型根系分泌檸檬酸、琥珀酸濃度差異

從圖5和圖6可見，不同紫云英基因型分泌的檸檬酸和琥珀酸酸濃度分別介于0．037～0．152mg／mL和0．005～0．314mg／mL之間。閩紫7號、84341022和浙紫5－12（這3個品種間無顯著差異）檸檬酸分泌量顯著高于閩紫1號、信陽種、弋江籽和余江大葉。在琥珀酸分泌量方面，其濃度閩紫7號除與84341022相近外，都顯著高于其他各個品種；閩紫7號琥珀酸分泌量是余江大葉的62．8倍。

圖5 不同紫云英基因型檸檬酸濃度差異Fig．5 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on citric acid

圖6 不同紫云英基因型琥珀酸濃度差異Fig．6 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on suceinic acid

2．5 不同紫云英基因型根系分泌有機酸總量差異

圖7 不同紫云英基因型有機酸總量差異Fig．7 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on total organic acid

有機酸總量為各個紫云英品種分泌的草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的總和。從圖7可以看出，土培條件下紫云英有機酸分泌總量介于0．075～1．181mg／mL；大體可以分為 3 類：8324411、浙紫5－12、8487711，84341022、余江大葉、閩紫1號、信陽種、閩紫6號，弋江籽；閩紫7號總的有機酸最大，弋江籽有機酸總量最低，僅為0．075 mg／mL，閩紫7號有機酸總量是弋江籽的約15倍；此外，閩紫7號顯著高于閩紫1號、信陽種、閩紫6號、余江大葉、84341022和弋江籽；但閩紫7號與8487711、浙紫5－12未見顯著差異。

2．6 不同紫云英基因型根系分泌各有機酸與生物量的關系

從圖8可以看出，紫云英分泌有機酸（草酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸）與植株生物量的相關擬合關系表明，紫云英根系分泌的草酸、乳酸、乙酸和檸檬酸與生物量擬合度較低，其對應的相關系數（r＜ɑ0．05），差異不顯著。然而，紫云英根系分泌的蘋果酸、琥珀酸與生物量擬合相關系數差異達到極顯著水平，呈極顯著正相關。因此，所分泌的蘋果酸和琥珀酸含量的高低可以一定程度上表征紫云英生物量高低，或者某種意義上說明其對土壤中難溶性養分的釋放與溶解發揮著重要作用，所釋放與溶解的養分可供紫云英吸收利用，進而影響紫云英生長及生物量。

2．7 不同紫云英基因型根系分泌有機酸總量與生物量的關系

圖8 紫云英根系分泌各有機酸與植株生物量的關系Fig．8 Relationship between plant biomass and each organic acid

圖9 根系分泌有機酸總量與植株生物量的關系Fig．9 Relationship between plant biomass and total organic acid

從圖9可以看出，紫云英根系分泌的有機酸總量與生物量呈顯著正相關關系。因此，有機酸分泌的高低對紫云英植株生長及生物量影響顯著。大量研究表明，有機酸對酸性土壤中 Al－P和 Fe－P中 Al3＋、Fe3＋的螯合有利，可使難溶性Al－P和Fe－P中的P釋放出來供植物吸收利用。本試驗結果顯示，紫云英在土培條件下可分泌6種成分有機酸，當然在實際條件下，所分泌的有機酸種類可能還遠遠高于這些，在利用高效液相色譜測定時只選定常見成分9種有機酸（另外3種酸是甲酸、酒石酸和馬來酸）進行標定。土壤養分的高低對紫云英生物量影響很大，然而在同等土壤背景條件下，作物有機酸分泌量勢必很大程度上影響植物的生長，它能充分與土壤中難溶性化合物中陽離子進行螯合反應，促進難溶性養分的溶解，釋放出有效養分供植物吸收利用。9個不同紫云英基因型中，分泌有機酸累積量最高的品種為閩紫7號，最低為弋江籽，其對應的生物量閩紫7號也是最高，雖然弋江籽的生物量不是最低，但也接近最低。

3 討論

蘭忠明等［17］報道了用溶液培養法收集不同紫云英基因型根系分泌物，顯現出有機酸的差異性，主要成分是草酸；個別基因型還分泌出少量酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等［13］；通過石英砂培養試驗，表明閩紫6號和閩紫1號在利用難溶性磷時都顯著高于余江大葉和弋江籽。不同紫云英基因型在不同磷源中，地上部、地下部吸磷量及總吸磷量也均表現為K－P＞Al－P＞Fe－P＞CK，紫云英對難溶性磷吸收利用時，對Al－P吸收富集優于Fe－P［14］；然而，在土培條件下，所有基因型都檢測到對應的有機酸（除弋江籽和蘋果酸外），3個重復中都有2個或3個數值即重復效應較好，但某些品種分泌的有機酸重復變異較大。溶液培養中在缺磷下，閩紫1號、閩紫6號兩種紫云英在草酸分泌方面顯著高于弋江籽和余江大葉，但在土培試驗中閩紫6號和閩紫1號草酸濃度含量雖高于弋江籽和余江大葉，然而統計分析閩紫6號、閩紫1號、余江大葉和弋江籽草酸含量未達顯著差異，可能是由于在土培收集根系分泌物抖土過程中根系一定程度受到損傷，導致根系分泌的有機酸濃度降低（溶液培養在理想條件下，根系損傷少）。前期采用石英砂培養研究結果表明：閩紫6號對難溶性磷的吸收量及生物量均高于浙紫5－12、弋江籽和余江大葉，土培試驗表明，閩紫6號的生物量都高于浙紫5－12、弋江籽和余江大葉，然而品種間未見顯著差異水平。田間磷高效試驗結果表明，閩紫7號在大田栽培適應性方面表現出磷高效特征，土培試驗結果也表明閩紫7號有機酸分泌總量最大其生物量也最高，其結果與水培、砂培、土培和田間試驗的結果一致。因此，可以得出，不同紫云英基因型根系分泌物有機酸不同，紫云英根系分泌的蘋果酸、琥珀酸與生物量擬合呈極顯著正相關，紫云英根系分泌的蘋果酸和琥珀酸含量高低可以一定程度上表征紫云英生物量高低。

［1］Jones D L．Organic acids in the rhizosphere－a critical review［J］．Plant and Soil，1998，205：25－44．

［2］Shen A L，Li X，Kanamori T，etal．Low－molecular－weight organic acids in two Japanese soils incubated with plant residues under different moisture conditions：I．Aliphatic acids［J］．Pedosphere，1997，7（1）：79－86．

［3］Strobel B W．Influence of vegetation on low－molecular－weight carboxylic acids in soil solution－A review［J］．Geoderma，2001，99：169－198．

［4］嚴小龍．根系生物學原理與應用［M］．北京：科學出版社，2007：115－142．

［5］Gardner W K，Parbery D G，Barber D A．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．I．Some characteristics of the soil／root interface［J］．Plant and Soil，1982，68（1）：19－32．

［6］Gardner W K，Parbery D G，Barber D A．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．II．The effect of varying phosphorus supply and soil type on some characteristics of the soil／root interface［J］．Plant and Soil，1982，68（1）：33－41．

［7］Gardner W K，Barber D A，Parbery D G．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．III．The probable mechanism by which phosphorus movement in the soil／root interface is enhanced［J］．Plant and Soil，1983，70（1）：107－124．

［8］谷俊濤，李金才，韓勝芳，等．異源表達白羽扇豆酸性磷酸酶基因對白三葉草磷吸收的影響［J］．草業學報，2007，16（4）：69－75．

［9］Ae N，Arihara J，Okada K，etal．Phosphorus uptake by pigeon pea and its role in cropping systems of the Indian subcontinent［J］．Science，1990，248（49－54）：477－480．

［10］Subbarao G V，Ae N，Otani T．Genetic variation in acquisition and utilization of phosphorus from iron－bound phosphorus in pigeon pea［J］．Soil Science and Plant Nutrition，1997，43（3）：511－519．

［11］Gahoonia T S，Asmar F，Giese H，etal．Root－released organic acids and phosphorus uptake of two barley cultivars in laboratory and field experiments［J］．European Journal of Agronomy，2000，12（3／4）：281－289．

［12］Shen H，Yan X L，Zhao M，etal．Exudation of organic acids in common bean as related to mobilization of aluminum－and iron－bound phosphates［J］．Environmental and Experimental Botany，2002，48（1）：1－9．

［13］趙明，沈宏，嚴小龍．不同菜豆基因型根系對難溶性磷的活化吸收［J］．植物營養與肥料學報，2002，8（4）：435－440．

［14］Johnson S E，Loeppert R H．Role of organic acids in phosphate mobilization from iron oside［J］．Soil Science Society of A－merica Journal，2006，70：222－234．

［15］Onthong J，Osaki M，Nilnood C，etal．Phosphorus status of some highly weathered soils in peninsulr Thailand and availability in relation to citrate and oxalate application［J］．Soil Science and Plant Nutrition，1999，45：627－637．

［16］師尚禮，曹致中，劉建榮．苜蓿根瘤菌溶磷和分泌植物生長素能力研究［J］．草業學報，2007，16（2）：105－111．

［17］蘭忠明，林新堅，張偉光，等．缺磷對紫云英根系分泌物產生及對難溶性磷活化的影響［J］．中國農業科學，2012，45（8）：1521－11531．

［18］蘭忠明，張輝，吳一群，等．不同紫云英基因型對難溶性磷吸收利用的影響［J］．生態環境學報，2011，20（10）：1454－1460．