異子蓬二型性種子萌發對鹽脅迫的響應

宋以剛，李利 ，曾歆花，鄧敏，張希明

(1.中國科學院新疆生態與地理研究所，新疆烏魯木齊830011;2.中國科學院上海辰山植物科學研究中心，上海201602;3.中國科學院遺傳與發育生物學研究所農業資源研究中心，河北石家莊050021;4.中國科學院大學，北京100049)

果實(種子)異型性是指同一植株產生不同形態或行為果實(種子)的現象，行為的差異主要體現在傳播能力和萌發差異等方面［1-2］。種子異型性是植物本身的遺傳特性和環境因素共同作用的結果，是植物為了適應惡劣環境而長期進化形成的一種生理、生態機制［2-3］。

異子蓬(Suaeda aralocaspica)是莧科(Amaranthaceae)藜亞科(Subfamily:Chenopodiaceae)堿蓬屬的一年生草本鹽生植物［4］。異子蓬主要分布于中亞及黑海沿岸，在我國僅分布于新疆準噶爾盆地南緣的鹽堿化沙質土及戈壁上［5］。目前，在新疆境內異子蓬的生境呈片段化分布，主要集中于準噶爾盆地南緣的一些鹽堿化嚴重且地下水位較高的干擾生境中。異子蓬的同一個植株上能夠產生形態差異明顯的2種類型果實:具有棕色種子的大型果和具有黑色種子的小型果;其種子差別明顯，具有顯著的種子二型性［5］。

鹽生植物種子萌發對鹽分的響應主要有2種方式:1)避鹽，高鹽誘導種子休眠，保持胚胎活力;2)耐鹽萌發，胚胎具有較強的耐鹽性，保證胚胎的成活［6-7］。異子蓬的二型性種子在萌發和休眠上具有顯著性差異，棕色種子沒有休眠且有耐高鹽的能力;而黑色種子的耐鹽能力差，休眠類型為非深度生理休眠［8-9］。異子蓬的二型性種子正好包含這2種策略，但已有的研究只是從萌發生態上闡明了這一現象，并沒有深入探討二型性種子在鹽脅迫下產生萌發差異的原因。

異子蓬棕色種子能夠在高鹽脅迫的條件下萌發，其剛伸長的小幼苗將面臨更顯著的鹽分脅迫，而它是怎樣適應鹽分脅迫的，目前尚不清楚。因此，本研究的目的在于:比較異子蓬二型性種子的滲透調節物質和鹽脅迫下萌發特性的差異，以及在鹽脅迫下萌發的棕色種子胚根和胚芽適應高鹽環境的不同策略。

1 材料與方法

1.1 種子采集處理及生境描述

異子蓬的新鮮種子于2010年10月3日采集于新疆阜康縣境內(N 44°04'，E 87°45')，采集后在通風條件下晾干，4℃冷藏保存備用。通過野外觀察發現，異子蓬生長在地下水位較淺且鹽堿化較為嚴重的準噶爾盆地南緣，生境呈片段化分布，其自然種群一般是單一優勢種的片層，極少有伴生種。

1.2 二型性種子滲透調節物質的檢測

選取成熟飽滿的棕色和黑色種子，每種類型的種子稱取3份，每份準確稱取0.2 g，共稱取6份。用3 mL濃硫酸和2 mL高氯酸進行硝化，定容至100 mL，取5 mL原液用凱氏定氮儀檢測全氮含量，再取2 mL原液用紫外分光光度計檢測全磷含量。另外，分別利用蒽酮比色法和改良型Lowry法對二型性種子內的可溶性糖和可溶性蛋白質進行檢測［10］。

1.3 二型性種子萌發對鹽脅迫的生理響應

選擇成熟飽滿的黑色種子和棕色種子進行萌發實驗，實驗共設置5個NaCl濃度梯度(200，400，800，1200，1600 mmol/L)和一個對照組(0 mmol/L)，每組設置3個重復，每個重復30粒種子。實驗在鋪有2層濾紙、直徑為9 cm的培養皿中進行，培養皿置于20℃、無光照的培養箱中培養21 d(3 d換1次溶液以保證鹽濃度的準確性)。實驗一，對處理24 h后的所有種子用去離子水沖洗3次后烘干，去除種皮，利用火焰光度計法測量胚胎內的K+、Na+含量。實驗二，每隔2 d觀察一次萌發的棕色種子(種子完全解螺旋，并且胚根開始生長視為完全萌發)。把每天萌發的種子從胚軸中間截斷分為胚根和胚芽兩部分，分別用游標卡尺測量其長度，并稱取它們的鮮重，去離子水沖洗后置于70℃下48 h烘干，稱其干重。把21 d內所有萌發的棕色種子(萌發率小于1/3的未作此處理，即NaCl濃度＞1200 mmol/L)，烘干后，用火焰光度計分別檢測胚根和胚芽中K+、Na+的含量［11-12］。

生物量指標共分為以下幾部分:總鮮重、胚根鮮重、胚芽鮮重、總干重、胚根干重、胚芽干重。胚根含水量=(胚根鮮重－胚根干重)/胚根鮮重、胚芽含水量=(胚芽鮮重－胚芽干重)/胚芽鮮重，胚根干重比=胚根干重/總干重、胚芽干重比=胚芽干重/總干重、胚根胚芽干重比=胚根干重/胚芽干重，總長度、胚根長度、胚芽長度、胚根長度比、胚芽長度比、胚根胚芽長度比、表型可塑性指數(phenotypic plasticity index，PI)=處理中某一性狀的最高值減去最低值后除以最高值［13］。

1.4 數據處理與分析

數據統計與作圖采用Microsoft Office Excel 2003和Origin 8.0進行。數據分析采用SAS 9.1.3軟件，實驗中均進行3個重復，同一類型不同處理間采用方差分析(ANOVA)進行差異顯著性比較，不同類型種子的同一處理間比較采用T檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 異子蓬二型性種子滲透調節物質的差異

異子蓬棕色種子的可溶性糖(P＜0.05)、可溶性蛋白質含量(P ＜0.01)、全氮(P＜0.0001)和全磷(P＜0.0001)都顯著高于黑色種子(表1)。其中，棕色種子的可溶性糖大約是黑色種子的1.5倍，說明棕色種子主要滲透調節物質的含量相當豐富。

表1 異子蓬二型性種子滲透調節物質的含量(平均值±標準誤差)及其差異顯著性分析Table 1 The content(mean±SE)and significance of difference analysis about the osmotic adjustment substances in the dimorphic seeds of S.aralocaspica g/kg

2.2 鹽分對異子蓬二型性種子的離子毒害作用

異子蓬二型性種子對鹽脅迫的響應有著明顯的差異。經過24 h鹽脅迫以后，隨著NaCl濃度的升高，棕色種子胚胎的Na+含量顯著升高，而K+的含量只有在NaCl濃度達到1600 mmol/L時才開始出現顯著的降低。然而，隨著NaCl濃度的升高，黑色種子胚胎的Na+和 K+的含量都沒有顯著性差異。另外，所有NaCl脅迫下，棕色種子的Na+和K+的含量都高于黑色種子(圖1)。

2.3 棕色種子萌發后胚根和胚芽對鹽脅迫的離子響應

棕色種子萌發以后，隨著NaCl濃度的增大，胚根和胚芽中的Na+含量都顯著增加，均在1200 mmol/L時達到最大值。胚根中Na+的含量除在400 mmol/L和800 mmol/L之間無顯著差異外，其余各濃度梯度間均有顯著性差異;胚芽中Na+的含量在NaCl濃度達到800 mmol/L以后沒有顯著升高。通過T檢驗發現，同一濃度下(對照除外)胚根和胚芽中Na+含量均存在顯著性差異(P＜0.01)。胚根K+對鹽脅迫較為敏感，在200 mmol/L的NaCl濃度下，其含量就顯著降低;但是，隨著NaCl濃度的進一步升高，K+含量維持在一個相對穩定的水平上，變化不明顯。胚芽中K+的含量沒有受NaCl濃度的影響，隨著NaCl濃度的升高，K+含量沒有顯著的變化規律。另外，通過T檢驗發現，同一濃度下胚根和胚芽中K+的含量均存在顯著性差異(P＜0.05)，隨著NaCl濃度的升高，胚芽K+含量均顯著高于胚根(圖2)。

圖1 培養24 h后異子蓬二型性種子胚胎Na+和K+含量(平均值±標準誤差)隨NaCl濃度的變化Fig.1 The content of K+and Na+(mean ±SE)in embryo of dimorphic seeds in S.aralocaspica after incubated 24 h at different concentrations of NaCl

圖2 不同NaCl濃度下異子蓬棕色種子萌發后胚根和胚芽中Na+和K+的含量(平均數±標準誤差)變化Fig.2 The content of K+and Na+(mean ±SE)in radicle and germ of germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

棕色種子在鹽脅迫下(與0 mmol/L對照相比)萌發以后，胚根和胚芽中的K+/Na+均顯著降低。隨著NaCl濃度的升高，胚根的K+/Na+顯著降低;胚芽的K+/Na+沒有顯著性差異。T檢驗發現在相同濃度下胚根的K+/Na+都顯著低于胚芽(P＜0.05)(圖3)。

圖3 異子蓬棕色種子萌發后胚根和胚芽中K+/Na+(平均數±標準誤差)隨NaCl濃度的變化Fig.3 The K+/Na+(mean ±SE)in radicle and germ in germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

2.4 胚根和胚芽鮮重、干重和含水量的差異

胚根的鮮重均高于胚芽的鮮重;但是隨著NaCl濃度的升高，胚根和胚芽鮮重的變化規律有著明顯的不同，胚根鮮重與0 mmol/L的對照相比沒有顯著性差異，但是胚芽鮮重有明顯的降低。另外，胚根和胚芽鮮重的極值均出現在NaCl濃度為400 mmol/L處(表2)。

胚根和胚芽的干重分配正好與鮮重相反，胚芽干重均大于胚根干重。隨著NaCl濃度的升高，胚根干重逐漸增大，除在200和400 mmol/L之間無差異外，其余各濃度之間的差異均達到顯著水平。總干重和胚芽干重在不同NaCl濃度下無顯著性差異。另外，通過T檢驗得出，胚芽干重除在400和1200 mmol/L的NaCl濃度下以外，均顯著高于胚根干重(P＜0.01)(表2)。

另外，隨著NaCl濃度的升高，胚根含水率和胚芽含水率逐漸下降。通過T檢驗發現，相同NaCl濃度下，胚根含水率都顯著高于胚芽含水率(P＜0.01)(表2)。

胚根干重比和胚芽干重比反映了生物量在胚根和胚芽之間分配的比例。從表2可以看出，胚根干重比隨著NaCl濃度的升高整體呈上升趨勢，在NaCl濃度為1200 mmol/L達到最高;而胚芽干重比整體呈下降的趨勢，在0 mmol/L處為最大。胚根干重比和胚芽干重比的顯著性差異轉折點均出現在400 mmol/L處。相同NaCl濃度下，胚芽干重比均高于胚根干重比，且通過T檢驗得出，除NaCl濃度為1200 mmol/L外，其他濃度下胚根干重比和胚芽干重比均呈顯著性差異(P＜0.01)。胚根胚芽干重比在不同NaCl濃度下均有顯著性差異，且在1200 mmol/L時達到最大值(表2)。

表2 不同NaCl濃度下異子蓬棕色種子萌發后胚根和胚芽生物量指標的差異Table 2 The difference of biomass index in radicle and germ in germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

2.5 胚根和胚芽生長速度及表型可塑性分析

隨著NaCl濃度的逐漸升高，總長度和胚芽長度逐漸下降，各濃度梯度間差異顯著;胚根長度則是先增加后減小，在200 mmol/L時達到最大值。相同NaCl濃度下，胚根長度均顯著大于胚芽長度(P＜0.05)(表2)。

胚根長度比和胚根胚芽長度比隨著NaCl濃度升高逐漸增大，而胚芽長度比則逐漸減小。胚根長度比、胚芽長度比和胚根胚芽長度比除在200和800 mmol/L之間無顯著性差異外，其他各濃度之間均有顯著性差異(表2)。

隨著NaCl濃度的增大，總長度、胚根長度和胚芽長度的表型可塑性指數逐漸下降，所以NaCl濃度越高，胚根和胚芽的形態可塑性就越低。通過T檢驗得出，相同NaCl梯度下，胚芽的表型可塑性指數均顯著高于胚根的表型可塑性指數(P＜0.05)(圖4)。

3 討論

植物在長期的環境適應過程中，進化形成了應對惡劣環境的獨特機制［14］。在惡劣環境中保證一定種群數量的存活是維持物種穩定的重要手段之一，產生不止一種類型的種子能夠降低時間適合度的變異，從而確保至少一部分后代在劇烈變化的環境中存活［3］。為了適應中亞地區的干旱和鹽堿環境，異子蓬經過長期的進化也形成了產生異型性種子的適應機制，其產生的二型性種子在形態和生理上都有著顯著的差異，黑色種子不耐鹽、具有非深度生理休眠，而棕色種子耐鹽能力強、無休眠［9］。

在新疆準格爾盆地南緣異子蓬的生境中，鹽分的分布主要集中在表層且分布的差異性較大，表層鹽分分布最小值只有300 mmol/L左右，最大值達到1300 mmol/L［9］。異子蓬的二型性種子在土壤表層以何種方式應對這種高鹽環境，保證每年種群數量的穩定至關重要。已有研究發現，許多鹽生植物和非鹽生植物物種的幼苗和胚根在NaCl濃度達到200～400 mmol/L時仍能夠繼續生長［15-19］。細枝鹽爪爪(Kalidium gracile)和鹽爪爪(Kalidium foliatum)在NaCl濃度達到400 mmol/L左右時，對胚根沒有損害［7，20-21］。在如此惡劣的鹽堿環境中，鹽生植物的種子在萌發初期是怎樣躲避鹽離子的毒害值得探討。

圖4 異子蓬棕色種子完全萌發后總長度、胚根長度和胚芽長度的表型可塑性指數隨NaCl濃度的變化Fig.4 Phenotypic plasticity index(mean ± SE)for total length，radicle length and germ length of completely germinated brown seeds of S.aralocaspica at different concentrations of NaCl

3.1 異子蓬二型性種子對鹽脅迫的不同適應策略

鹽生植物的滲透調節物質主要是一些有機可溶性物質和無機離子，這些物質的含量高低是植物耐鹽能力的重要依據［22-23］;高含量的養分物質是提高種子對逆境忍受力的重要保證［24］。異子蓬棕色種子的可溶性糖、可溶性蛋白質、全氮和全磷這些有機可溶性物質都顯著高于黑色種子，說明棕色種子的耐鹽能力顯著高于黑色種子。另外，已有研究發現，棕色種子的無機離子含量均顯著高于黑色種子［25］。綜合分析，我們發現棕色種子在滲透調節物質上的優勢，與棕色種子在鹽脅迫下能夠迅速吸水萌發的報道完全吻合［9］。

高鹽環境下，植物體內維持正常的礦質營養元素與Na+比值是植物耐鹽性的生理表現之一，鹽脅迫下植物體內保持較高的K+濃度(K+/Na+)對維持正常的代謝十分重要［11，26-27］。在受到鹽脅迫時，棕色種子的K+始終維持在一個很高的水平;并且棕色種子的K+含量始終高于黑色種子，這些都是棕色種子能夠在高鹽脅迫下萌發的重要物質保障。棕色種子胚芽中的K+含量顯著高于胚根，這是保證胚芽中有機物質進行代謝，促進胚芽生長的物質基礎。另外，當NaCl濃度大于200 mmol/L時，胚根K+的濃度保持穩定，也是維持正常代謝并確保其迅速生長，脫離土壤表層的高鹽環境的重要保障。棕色種子胚芽的這種維持較高K+/Na+的方式是其降低鹽害保持細胞活力的重要策略之一。

作為真鹽生植物，可在體內積累較高濃度的無機離子來降低滲透勢，其中主要是Na+，以便于能在含鹽量很高的土壤中吸收水分［28］。當環境鹽分過高，植物吸收大量Na+后，會造成離子穩態的破壞，即當植物吸收過多Na+的同時，會導致植物體內的K+等營養離子的大量流失［29］。隨著鹽濃度的增大，胚根和胚芽中Na+的含量都顯著增加，以降低體內的滲透勢，保證種子吸水，為其在高鹽環境中萌發提供了有力的保證。

3.2 棕色種子的胚根和胚芽對鹽脅迫下生物量響應

萌發初期，胚根生長在含鹽量較高的土壤中，為了減少鹽分對胚根內部結構的損害，胚根通過吸收大量的水分來緩解離子毒害［30-31］。棕色種子萌發后胚根的含水量高，并且顯著高于胚芽;隨著鹽分增加，胚根Na+含量和干重都顯著增加，所以大量吸水是棕色種子完全萌發后胚根應對鹽脅迫的策略之一。在離子變化幅度較小的前提下，胚芽干重顯著高于胚根干重，說明胚芽的有機物質含量較高，是其提高細胞的滲透壓，避免大Na+大量進入細胞產生毒害作用的物質基礎。所以我們推測，胚根主要通過大量吸水來稀釋鹽離子的毒害作用，而胚芽可能主要靠體內的大量的滲透調節物質來抵抗鹽離子的毒害。

萌發時胚根的迅速生長也是胚胎躲避表層土壤鹽脅迫的重要策略之一，異子蓬棕色種子在不同鹽分梯度下完全萌發時胚根伸展的長度均能達到2 cm左右，胚根長度比隨著鹽濃度的增大逐漸增大，說明在高鹽脅迫下，胚胎的生長主要分配給胚根，以期能夠迅速擺脫高鹽環境。形態可塑性是植物能夠適應多樣化生境的重要原因之一，高的可塑性使其具有較寬的生態幅和拓殖能力，從而緩解生境的選擇壓力［32］。異子蓬棕色種子的胚根在NaCl濃度達到800 mmol/L時，其表型可塑性依然較高，說明它對鹽脅迫具有較強的適應能力。

4 結論

綜上所述，異子蓬的二型性種子在鹽脅迫下體現出了不同的適應策略，黑色種子萌發受到鹽分的抑制，以休眠的狀態逃避高鹽環境;而棕色種子高含量的滲透調節物質不但使其能夠在高濃度的鹽脅迫下迅速吸水萌發，還為其萌發后迅速生長以躲避鹽害并保證植株的正常存活提供了有利的物質基礎。棕色種子萌發以后，胚根受鹽離子的毒害較為明顯，但是胚根和胚芽以不同的方式來化解了鹽離子的毒害，胚根通過迅速的大量吸收水分稀釋鹽離子的毒害作用，并且迅速伸長擺脫土壤表層的高鹽環境;而胚芽則依賴其子葉的干重優勢和較高K+/Na+來抵御Na+的毒害作用。這些在長期進化過程中形成的適應機制是異子蓬在不穩定的西北干旱區的鹽堿環境中維持種群穩定的重要生存智慧。

［1］Venable D L.The evolutionary ecology of seed heteromorphism［J］.American Naturalist，1985，126:577-595.

［2］Imbert E.Ecological consequences and ontogeny of seed heteromorphism［J］.Perspectives in Plant Ecology Evolution and Systematics，2002，5:13-36.

［3］王雷，董鳴，黃振英.種子異型性及其生態意義的研究進展［J］.植物生態學報，2010，34(5):578-590.

［4］Missouri.密蘇里植物園植物資料庫［EB/OL］.(2005)［2013-09-27］.http://www.tropicos.org/Name/50338254.

［5］李安仁.中國植物志［M］.北京:科學出版社，1979.

［6］Ungar I A.Halophyte seed germination［J］.Botanical Review，1978，44:233-264.

［7］Qu X X，Baskin J M，Wang L，et al.Effects of cold stratification，temperature，light and salinity on seed germination and radicle growth of the desert halophyte shrub，Kalidium caspicum(Chenopodiaceae)［J］.Plant Growth Regulation，2008，54:241-248.

［8］李利，楊小林，王偉華.異子蓬二態性種子萌發對生境條件的響應［J］.干旱區研究，2007，24(6):6830-6834.

［9］Wang L，Huang Z Y，Baskin C C，et al.Germination of dimorphic seeds of the desert annual halophyte Suaeda aralocaspica(Chenopodiaceae)，a C(4)plant without Kranz Anatomy［J］.Annals of Botany，2008，102:757-769.

［10］宋松泉，程紅焱，龍春林，等.種子生物學研究指南［M］.北京:科學出版社，2005.

［11］高奔，宋杰，劉金萍，等.鹽脅迫對不同生境鹽地堿蓬光合及離子積累的影響［J］.植物生態學報，2010，34(6):671-677.

［12］武高林，陳敏，杜國禎.三種高寒植物幼苗生物量分配及性狀特征對光照和養分的響應［J］.生態學報，2010，30(1):60-66.

［13］馬金虎，郭數進，王玉國，等.種子引發對鹽脅迫下高粱幼苗生物量分配和滲透物質含量的影響［J］.生態學雜志，2010，29(10):1950-1956.

［14］Ungar I A.Population ecology of halophyte seeds［J］.Botanical Review，1987，53:301-334.

［15］彭云玲，李偉麗，王坤澤，等.NaCl脅迫對玉米耐鹽系與鹽敏感系萌發和幼苗生長的影響［J］.草業學報，2012，21(4):62-71.

［16］楊景寧，王彥榮.NaCl脅迫對四種荒漠植物種子萌發的影響［J］.草業學報，2012，21(5):32-38.

［17］Khan M A，Ungar I A.The effect of salinity and temperature on the germination of polymorphic seeds and growth of Atriplex triangularis willd［J］.American Journal of Botany，1984，71:481-489.

［18］Tobe K，Zhang L，Omasa K.Effects of NaCl on seed germination of five nonhalophytic species from a Chinese desert environment［J］.Seed Science and Technology，1999，27:851-863.

［19］Tobe K，Zhang L P，Qiu G Y Y，et al.Characteristics of seed germination in five non-halophytic Chinese desert shrub species［J］.Journal of Arid Environments，2001，47:191-201.

［20］Shen Y Y，Li Y，Yan S G.Effects of salinity on germination of six salt-tolerant forage species and their recovery from saline conditions［J］.New Zealand Journal of Agricultural Research，2003，46:263-269.

［21］曾幼玲，蔡忠貞，馬紀，等.鹽分和水分脅迫對兩種鹽生植物鹽爪爪和鹽穗木種子萌發的影響［J］.生態學雜志，2006，25(9):1014-1018.

［22］Yeo A R，Flowers T J.Salt tolerance in the halophyte Suaeda maritima L.Dum.:Evaluation of the effect of salinity upon growth［J］.Journal of Experimental Botany，1980，31:1171-1183.

［23］劉愛榮，張遠兵，鐘澤華，等.鹽脅迫對彩葉草生長和滲透調節物質積累的影響［J］.草業學報，2013，22(2):211-218.

［24］傅家瑞.種子生理［M］.北京:科學出版社，1985.

［25］宋以剛，李利，張希明，等.異子蓬二型性種子的種皮結構及離子含量差異［J］.植物研究，2012，32(3):290-295，319.

［26］Tester M，Davenport R.Na+tolerance and Na+transport in higher plants［J］.Annals of Botany，2003，91:503-527.

［27］楊小菊，趙昕，石勇，等.鹽脅迫對砂藍刺頭不同器官中離子分布的影響［J］.草業學報，2013，22(4):116-122.

［28］Song H，Feng G，Tian C Y，et al.Osmotic adjustment traits of Suaeda physophora，Haloxylon ammodendron and Haloxylon persicum in field or controlled conditions［J］.Plant Science，2006，170:113-119.

［29］高奔，宋杰，劉金萍，等.鹽脅迫下囊果堿蓬出苗狀況及苗期抗鹽性［J］.生態學報，2009，29(11):6131-6135.

［30］李品芳，楊志成.NaCl脅迫下高羊茅生長及K+、Na+吸收與運輸的動態變化［J］.草業學報，2005，14(4):58-64.

［31］楊成龍，段瑞軍，李瑞梅，等.鹽生植物海馬齒耐鹽的生理特性［J］.生態學報，2010，30(17):4617-4627.

［32］Sultan S E.Phenotypic plasticity for plant development，function and life history［J］.Trends in Plant Science，2000，5:537-542.