高速逆流色譜結(jié)合制備液相色譜分離純化桂枝中化學(xué)成分

杭 偉，張欽德，王 曉，林昌虎，段文娟*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250355;2山東中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，煙臺(tái) 264000;3山東省科學(xué)院山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014;4 貴州省理化測(cè)試分析研究中心 貴州省科學(xué)院，貴陽 550002

桂枝為樟科樟屬植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝，主產(chǎn)于廣西、廣東、云南［1］。桂枝具有解表散寒、溫經(jīng)通脈、化氣行水等，《傷寒論》和《金匱要略》中多處使用桂枝組方［2］。臨床上主要用于治療風(fēng)濕痹痛、小便不利、濕阻、脅痛等［3］。桂枝中主要成分是桂皮酸、桂皮醛、香豆素類等化合物，現(xiàn)代研究表明此類化合物是桂枝發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)靜、平喘、抗過敏等作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，此類化合物的穩(wěn)定性較差，在高溫、光照等條件下容易發(fā)生變化，采用常規(guī)色譜方法很難得到大量高純度化合物。因此，研究建立相關(guān)成分快速高效的分離純化方法對(duì)其活性研究具有重要意義。.

高速逆流色譜法(high-speed counter-current chromatography，簡稱HSCCC)是一種不需要固態(tài)載體的液-液分配色譜技術(shù)，具有操作簡便、可避免因不可逆吸附而引起的樣品損失等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化中［4，5］。本研究將高速逆流色譜技術(shù)應(yīng)用于桂枝化學(xué)成分的研究，但是前期研究發(fā)現(xiàn)僅使用高速逆流色譜很難一次性得到單體化合物，因此，采用高速逆流色譜結(jié)合制備高效液相色譜的方法進(jìn)行分離純化，共得到4 種純度大于95%的化合物，采用核磁共振波譜法鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。實(shí)現(xiàn)了對(duì)桂枝中化學(xué)成分快速、有效的分離純化，為桂枝資源的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了技術(shù)和物質(zhì)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

GS10A 型高速逆流色譜儀(北京艾美林科技有限公司)、TBP 泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.3mm，分離體積230 mL，β 值為0.5～0.8)、8823B-紫外檢測(cè)器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限司)、3057-11 記錄儀(重慶川儀總廠有限公司);Waters 600-996 高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)，美國Waters公司);Varian INOVA-600 核磁共振波譜儀(美國Varian 公司);Agilent 1100 Series 6320 ion-trap 質(zhì)譜儀(美國Agilent 公司)。

實(shí)驗(yàn)用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇均為分析純(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，所用水為蒸餾水;液相色譜用甲醇為色譜純(美國天地公司)，所用水為純凈水;桂枝藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為樟科樟屬植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥嫩枝。

1.2 桂枝粗提物制備

桂枝藥材10 Kg 粉碎后用95%的乙醇溶液滲濾提取，提取液減壓濃縮后用水混懸，然后分別用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取三次，合并濾液，正丁醇部分減壓濃縮，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HSCCC 分離

1.3.1 兩相體系的配制

兩相溶劑體系及樣品溶液的制備，本實(shí)驗(yàn)選擇溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶6∶4，v/v)，配制約1500 mL，置于分液漏斗中，劇烈振蕩使其充分混合后靜置分層，平衡后將上下兩相分開，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，分別超聲脫氣10 min，備用。

稱取桂枝正丁醇相樣品170 mg，加入上下相各4 mL，振蕩使其完全溶解，備用。

1.3.2 HSCCC 分離制備過程

將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)以20 mL/min 的流速泵入HSCCC 分離管中，待上相充滿整個(gè)分離管后，調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速達(dá)850 rpm，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2.0 mL/min 流速泵入下相(流動(dòng)相)，檢測(cè)波長為254 nm。當(dāng)流動(dòng)相從主機(jī)口流出時(shí)，說明體系已達(dá)到流體動(dòng)力學(xué)平衡，此時(shí)將已準(zhǔn)備好的8mL 樣品注入HSCCC 儀，同時(shí)開始采集數(shù)據(jù)，根據(jù)色譜圖收集目標(biāo)成分。

1.3.3 分配系數(shù)(KD)的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的KD值測(cè)定方法［6］，取桂枝正丁醇相樣品置于10 mL 試管中，加入上下相各2 mL，劇烈振蕩1 min，使樣品充分溶解，靜置分層，取上下相各5 μL，用HPLC 分別進(jìn)行檢測(cè)，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，KD=A1/A2。

1.4 制備高效液相分離

1.4.1 Pre-HPLC 分離制備過程

將HSCCC 分離出的餾分濃縮至干，用少量甲醇溶解，過0.45 μm 濾膜，采用高效液相色譜進(jìn)行制備分離，用60%甲醇等度洗脫，流速3.0 mL/min，檢測(cè)波長247 nm.根據(jù)峰形分別收集流出液，流出液減壓濃縮干。

1.4.2 HPLC 條件

色譜柱:Inertsil ODS-SP 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，柱溫:25 ℃。流動(dòng)相A:甲醇;流動(dòng)相B:純凈水溶液;線性梯度洗脫程序:0～25min，30%A～100%A;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長:247 nm。采用此條件對(duì)桂枝正丁醇相總樣及逆流所得餾分進(jìn)行分析。

1.4.3 Pre-HPLC 條件

色譜柱:YMC-pack ODS-A 柱(250 mm × 10 mm，5 μm)，柱溫:25 ℃。流動(dòng)相:甲醇-水(60∶40)，流速:3.0 mL/min;進(jìn)樣量:50 μL;檢測(cè)波長:247 nm。采用此條件對(duì)桂枝正丁醇相逆流所得餾分進(jìn)行分離。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC 分離條件的優(yōu)化

在高速逆流色譜法的分離應(yīng)用中，溶劑體系的選擇是分離中的首要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，溶劑體系是否合適是由目標(biāo)化合物在其中的分配系數(shù)KD來衡量的，適宜的溶劑系統(tǒng)對(duì)于目標(biāo)化合物來說分配系數(shù)應(yīng)在0.5～2 之間。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)目標(biāo)化合物的極性采用對(duì)石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系，因?yàn)檫@四相體系具有較寬的極性范圍以及良好的溶解度。如表1 所示，選擇了幾種不同的溶劑系統(tǒng)，進(jìn)行K 值測(cè)量。當(dāng)采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶8∶2 及8∶2∶7∶3，v/v)為兩項(xiàng)溶劑系統(tǒng)時(shí)，KD值較小，如果采用這兩種溶劑系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致分離時(shí)間太短，達(dá)不到良好的分離效果，難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離純化。采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶5∶5，v/v)的體系時(shí)，KD值偏大，雖然取得了很好的分離效果，但是分離時(shí)間較長，也不利于快速高效的分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有當(dāng)采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶5∶5，v/v)體系時(shí)，目標(biāo)化合物可得到較理想的分離效果且分離時(shí)間較短。

表1 兩種餾分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)Table 1 KDof two fractions in different solvent system

2.2 HSCCC 分離純化結(jié)果

選用溶劑體系石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(8∶2∶6∶4，v/v)按照1.3 節(jié)所述的方法對(duì)桂枝樣品進(jìn)行HSCCC 分離，根據(jù)HSCCC 譜圖分段收集，分離結(jié)果如圖1 所示，經(jīng)HPLC 檢測(cè)，峰1 為化合物1 和化合物2 混和物，峰2 為化合物3 和化合物4 混和物。所以本文采用Pre-HPLC 的方法繼續(xù)分離純化目標(biāo)化合物。

圖1 桂枝正丁醇相高速逆流色譜圖Fig.1 HSCCC figure of Cinnamomum cassia Presl in n-butonal phase

2.3 Pre-HPLC 分離純化結(jié)果

將HSCCC 分離出的餾分1 和餾分2 分別濃縮至干，用少量甲醇溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，采用制備型高效液相色譜進(jìn)行分離，用60%甲醇/水等度洗脫，流速3 mL/min，檢測(cè)波長247 nm。根據(jù)峰形分別收集流出液，流出液減壓濃縮干燥.分別得到化合物1，化合物2，化合物3 化合物4。制備后化合物1、2、3、4 的純度均達(dá)到95%以上。圖2 為餾分1和2 的制備液相圖。

圖2 餾分1 和2 的制備液相圖(A:為餾分1 制備液相圖;B:餾分2 的制備液相圖)Fig.2 HPLC figures of fraction 1 and 2(A:HPLC figure of fraction 1，B:HPLC figure of fraction 2)

2.4 HPLC 分離條件的優(yōu)化

分別考察了，甲醇-水、乙腈-水溶液作為流動(dòng)相時(shí)各組分的分離情況，結(jié)果表明當(dāng)流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為水溶液的時(shí)候，化合物得到很好的分離，所以本實(shí)驗(yàn)選用甲醇-水作為流動(dòng)相。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色針晶(甲醇)。1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ:8.02(1H，d，J=9.6Hz，H-4)、7.73(1H，d，J=7.8 Hz，H-7)、7.61(1H，td，J=7.8，1.8 Hz，H-6)、7.37 (1H，d，J=7.2 Hz，H-5)、7.35(1H，d，J=7.8 Hz，H-8)、6.44(1H，d，J=9.6 Hz，H-3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］對(duì)照基本一致，故鑒定化合物1 為香豆素。

圖3 桂枝正丁醇相總樣及各化合物的HPLC 譜圖Fig.3 HPLC figures of total sample and each components from Cinnamomum cassia Presl in n-butanol phase

化合物2 白色無定型粉末(甲醇)。1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.96(1H，d，J=15.6 H z，H-7)、7.57 (1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6)、7.35(1H，td，J=7.2，1.8 Hz，H-4)、7.02(1H，d，J=7.8 Hz，H-3)、6.97(1H，td，J=7.8 Hz，H-5)、6.50(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)、3.89 (3H，s，OCH3)。13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ:171.1 (-COOH)、159.9(C-2)、141.4 (C-7)、132.7 (C-4)、129.6 (C-6)、124.2(C-1)、121.8 (C-8)、119.4 (C-5)、112.3(C-3)、56.2(OCH3)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］對(duì)照基本一致，故鑒定化合物2 為反式-鄰甲氧基桂皮酸。

化合物3 油狀物，1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:7.66 (1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，7.59(2H，m，H-2，6)，7.41 (1H，m，H-4)，7.39 (2H，m，H-3，5)，6.48 (1H，d，J=16.2 Hz，H-8)。13C NMR(CD3OD，150 MHz)δ:169.9(CO)，145.2(C-7)，134.6(C-1)，130.4(C-4)128.8 (C-3，5)，128.2 (C-2，6)，118.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］中報(bào)道的桂皮酸基本一致，確定化合物3 為桂皮酸。

化合物4 淡黃色液體，1H NMR (600 MHZ，CDCl3)δ:7.57～7.62 (2H，m)，6.74 (dd，反式雙鍵，H-2)，9.71 (CHO)。13C NMR (150 MHZ，CDCl3)δ:133.2～133.9(C-4～9)，100.0，157.9(C-2，3)，198.8(CHO)。以上理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致，確定化合物4 為反式桂皮醛。

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