HPLC 法測定神安顆粒中五味子醇甲含量的研究

易延逵，蔡光先，楊永華

1南方醫科大學，廣州 510515;2 湖南中醫藥大學，長沙 410006

神安顆粒是湖南中醫藥大學蔡光先教授的經驗方，由天麻、酸棗仁、丹參、首烏藤、百合花、五味子等6 味藥組成，功能益氣養血、疏郁定驚、清心除煩、補腦安眠。用于各種慢性疾病引起的頭昏眼花、心神焦悴、失眠多夢、記憶力減退、疲倦無力等。安神原方應用方法為:天麻、酸棗仁、丹參、首烏藤、百合花、五味子等各味粉碎成粗粉，開水泡服。很明顯，原方應用不方便，服用量大，服用困難，口感苦澀。鑒于神安顆粒藥方療效確切、應用廣泛及市面已有劑型的特點與現代人們用藥的要求，我們選擇神安處方為研究載體，對原工藝進行改進，采用超細粉體技術及現代提取工藝等現代制藥工藝，研制神安顆粒制劑，在保持傳統中醫藥特色的基礎上，大量采用現代制藥技術，提高藥物的生物利用度。

在對中藥質量控制的研究中，我們提出了應對中藥進行多指標質量控制，即根據中藥制劑的成分分析、制備工藝及其與功能主治、相關藥效作用等，確定中藥所含有的具體各類成分，進而根據每一類成分的提取方法和儀器條件制定出相應的含量測定指標。神安顆粒基本工藝為天麻粉碎成微粉;丹參、五味子、百合花加90%乙醇滲漉提取其極性較小脂溶性成分;丹參、五味子、百合花醇提后藥渣與酸棗仁、夜交藤加水提取，最后加入適量輔料制成顆粒。用于各種原因引起的心胸煩躁，失眠多夢，頭昏乏力，記憶力減退等癥狀。根據神安顆粒的組成、功能主治和工藝，綜合考慮，主要含有三類成分，一是貴細藥材天麻經過超微粉碎直接入藥，故含有以天麻素為指標性成分的天麻苷類成分;二是五味子、丹參等采用高濃度醇提，含有以五味子醇甲、丹參酮ⅡA為指標性成分的脂溶性成分;三是各藥材經過水提，含有多量的水溶性成分，以丹參素、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 等為指標性成分。本文采用HPLC 建立以五味子醇甲為指標性成分的脂溶性成分的含量測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀(HPLC);色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5.0 μm);處理軟件:ChemStation 數據處理軟件。UV-2401 可見紫外分光光度儀(日本島津);電子天平(0.001g，德國Sartrius BP110S)。

五味子醇甲對照品(批號:110857-200709，由中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用);神安顆粒(自制);甲醇為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

參照有關文獻報道［4-10］，選擇HPLC 法測定五味子醇甲含量，并進行了方法學考察。

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

流動相:甲醇-水(60∶40);檢測波長為250 nm。理論板數按五味子醇甲峰計算不低于2000。

2.2 檢測波長的選擇

根據五味子醇甲的理化性質，在紫外區域有最大吸收，故取五味子醇甲對照品，采用甲醇配成約0.3 mg/mL 的溶液，在200～400 nm 波長范圍內掃描，結果五味子醇甲在250 nm 波長處有最大吸收，與文獻報道一致，可作為HPLC 法測定五味子醇甲含量的檢測波長。

2.3 供試品溶液制備方法的比較

取神安顆粒0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，分別超聲處理(功率:240W，頻率:45Hz)10 min、30 min、1 h，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續濾液，作為供試品溶液。測定，計算，結果見表1。從表1 中可見，以超聲提取30 min 為宜。

表1 不同提取時間對五味子醇甲含量的影響Table 1 Effect of different time to the content of Schisandrin

2.4 對照品溶液的制備

取五味子醇甲對照品15 mg，精密稱定，置100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(每mL 中含五味子醇甲0.15 mg)。

2.5 測定法

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定。在選定條件下，五味子醇甲峰與樣品中其它組分色譜峰可達基線分離，按五味子醇甲峰計算，理論板數在2000 以上，對照品、供試品色譜圖分別見附圖1(A、B)。

圖1 五味子醇甲對照品(A)、神安顆粒樣品(B)及陰性對照(C)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)，Shenan granules sample (B)and blank (C)

2.6 專屬性考查

按處方配比稱取除五味子以外的其他藥材適量，按制備工藝制成缺五味子的陰性樣品，同法制備缺五味子的陰性樣品溶液。按“2.5”項所述測定法測定，即得陰形樣品色譜圖，結果見附圖1(C)。

2.7 方法學考察

2.7.1 線性范圍

精密吸取對照品溶液1、5、10、20、40 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量(μL)為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，回歸方程為:Y=1923.4X +2.1234，R2=1.000。結果表明五味子醇甲在0.15～6.0 μg 范圍內線性關系良好。

2.7.2 精密度試驗

精密吸取供試品溶液10 μL，分別進樣6 次，依法測定，結果RSD 值為1.98%。表明本方法精密度較好。

2.7.3 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定，結果24h 內峰面積RSD 值為2.77%。表明供試品溶液在24 h 內峰面積值基本穩定。

2.7.4 重復性試驗

取同一批樣品6 份，同法制備供試品溶液，依法測定，結果RSD 值為2.86%。表明本方法重復性較好。

2.7.5 加樣回收率試驗

取已測定含量的樣品適量，共6 份，精密稱定，分別加入五味子醇甲對照品溶液1 mL(0.13 mg/mL)，即0.13 mg，按供試品溶液的制備方法處理，測定峰面積，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 回收率測定結果Table 2 Results of recovery determining

結果表明，本方法加樣回收率較好。

2.7.6 對照品純度檢查

取濃度為50 μg/mL 的五味子醇甲對照品溶液30 μL，按質量標準中含量測定項下的方法進行試驗，結果檢出其純度為99.5%。

2.8 樣品含量測定

取樣品三批，依法進行含量測定，結果見表3。

表3 三批樣品含量測定結果Table 3 Quantification results of schisandrin in 3 batch’s sample

2.9 藥材中五味子醇甲含量測定試驗

取五味子藥材三批，按《中國藥典》2010年版一部天麻項下含量測定方法檢驗，結果其五味子醇甲含量分別為0.5779%、0.6008%、0.5516%，液相色譜圖見圖2。

用五味子醇甲含量為0.5779%的藥材投料試制樣品，結果含量為1.255 mg/g。經計算本品轉移率為86.87%。《中國藥典》規定天麻藥材中五味子醇甲含量不得少于0.40%，如采用該含量的藥材投料，按60.0%的轉移率計算，本品中五味子醇甲含量為0.6 mg/g。根據上述結果，暫定本品含天麻以五味子醇甲計，不低于0.600 mg/g。

3 討論與結論

建立科學有效的中藥質量控制體系，進行中藥質量的控制研究，一直是中醫藥研究領域最重要的領域之一。中藥質量控制研究也隨著現代分析技術、儀器設備制造技術的發展而不斷的發展。我們在對中成藥質量控制的研究中，提出了應該采用多指標控制中成藥的質量，應該根據中藥制劑的成分分析、制備工藝及其與功能主治、相關藥效作用等來確定需要控制的指標類成分。

圖2 五味子醇甲對照品(A)及五味子藥材(B)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of schisandrin standard (A)and Fructus Schisandrae sample (B)

神安顆粒采用了三種工藝，即超微粉碎工藝、醇提工藝、水提工藝，而其原料藥材成分也基本可以分為三類，即以天麻素為指標成分的天麻苷類成分;以五味子醇甲、丹參酮ⅡA 為指標性成分的脂溶性成分;以丹參素、斯皮諾素、酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B 等為指標性成分的水溶性成分。因而其質量控制也應建立三類成分的質量控制指標。

五味子是神安顆粒的主要藥物，也為含脂溶性成分的主要藥物，五味子醇甲為其指標成分，2010版中國藥典［4］五味子中五味子醇甲采用的也是高效液相色譜(HPLC)法，為此我們對其進行了研究，采用HPLC 法建立其含量測定方法。2010 版中國藥典五味子中五味子醇甲的高效液相色譜含量測定方法中，和有關文獻采用的有關條件有一定差異，經過反復實驗，本文優化了神安顆粒中五味子醇甲的含量測定方法，并選擇了供試品溶液的處理方法，結果樣品分離效果好，測得神安顆粒中五味子醇甲含量約為1.30 mg/g。

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