白藜蘆醇對高脂膳食肥胖及肥胖抵抗小鼠抗氧化與淋巴細胞亞群免疫功能調節的研究

王 斌，孫 進，李祥輝，施用暉，樂國偉*

1江南大學食品科學與技術國家重點實驗室;2 江南大學食品學院，無錫 214122

肥胖作為世界范圍內的公共衛生問題，同時與心血管疾病、動脈粥樣硬化等慢性病密切相關［1］。長期高脂膳食是導致肥胖發生的重要因素，并伴有氧化應激和慢性炎癥反應的發生［2］。然而有研究指出同一品系動物相同高脂膳食的情況下，有些動物發生肥胖，被稱為肥胖表型，有些動物不發生肥胖，被稱為肥胖抵抗表型［3］。白黎蘆醇(R)是一種非黃酮類多酚化合物，其主要在減肥、保護心血管以及減輕炎癥損傷等方面發揮重要作用［4］。但白藜蘆醇對高脂膳食肥胖及肥胖抵抗小鼠氧化應激和淋巴細胞免疫功能紊亂的調節作用目前尚不清楚。

本實驗以高脂日糧長期飼喂小鼠，研究白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠降血脂、抗氧化作用與淋巴細胞亞群免疫功能調節的影響。探討白藜蘆醇抗氧化活性與淋巴細胞亞群免疫調節功能之間的關系，為進一步闡明白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠免疫調節作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

白藜蘆醇(上海諾特生物科技有限公司);單抗試劑:PE-Cy5 anti-mouse CD3e(克隆號:145-2C11)、FITC anti-mouse CD4(L3T4)(克隆號:GK1.5)、PE anti-mouse CD8a(Ly-2)(克隆號:53-6.7)、PE-Cy7 anti-mouse CD25(克隆號:PC61.5)、APC anti-mouse FoxP3(克隆號:FJK-16s)(美國eBioscience 公司);固定劑、破膜劑(美國eBioscience 公司);EZ-SepTMMouse 1X 淋巴細胞分離液(深圳市達科為生物技術有限公司);其余試劑均為分析純。

UV1100 型紫外可見分光光度計(北京瑞利科學儀器有限公司)，Multiskan Mk3 酶標儀(美國Thermo 公司)，FACSCalibur 流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

選用6 周齡雄性C57BL/6 小鼠72 只(上海斯萊克實驗有限責任公司)，一周預飼后，按體重隨機分成2 組:即Control 組(正常日糧)8 只，HFD 組(高脂日糧)64 只，飼喂13 周后，HFD 組小鼠根據體重由高到低排序，將體重最高的前16 只小鼠作為肥胖(DIO)組，其平均體重顯著高于Control 組小鼠體重，將體重最低的后16 只小鼠作為肥胖抵抗(DR)組，其平均體重與Control 組小鼠無顯著性差異。HFD 組剩余32 只小鼠從本實驗中剔除［5］。而后將DIO 組與DR 組小鼠各自隨機分兩組，每組8 只，分別飼喂高脂日糧、高脂日糧+0.06%白藜蘆醇［6，7］(高脂日糧中白藜蘆醇的添加劑量為0.06%，混合后制粒)13 周，自由采食。日糧配方見表1。每周稱體重1 次，飼養結束后，各組小鼠隔夜禁食12 h，乙醚麻醉小鼠后，摘眼球取血，肝素抗凝，一部分抗凝血用于淋巴細胞亞群檢測，另一部分抗凝血4000 rpm 離心15 min，取上層抗凝血漿，用于血脂檢測。斷頸椎處死小鼠，取出脾臟，一部分脾臟研磨制成10%組織勻漿，4000 rpm 離心15 min，取脾臟勻漿上清液用于抗氧化酶活性、MDA 含量檢測。另一部分脾臟研磨后，用于脾臟淋巴細胞亞群檢測。

1.2.2 血脂含量檢測

血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)按神州英諾華公司試劑盒進行測定。

1.2.3 抗氧化酶活性及MDA 含量檢測

總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)按南京建成生物工程研究所試劑盒進行測定;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)采用DTNB 比色法測定［8］。

表1 實驗日糧配方及營養組成Table 1 Formula and nutrients content of the diet (%)

1.2.4 外周血淋巴細胞亞群檢測

小鼠眼球取血后，每個樣本取200 μL 抗凝血，紅細胞裂解液后，平均加入到2 個上樣管中，一管避光分別標記CD3+、CD4+、CD8+單抗(按試劑說明書加量)，混勻，室溫避光孵育30 min 后，PBS 洗1次，0.5 mL PBS 重懸細胞，混勻后上機檢測外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞含量。一管避光標記CD4+和CD25+單抗(按試劑說明書加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，加入固定劑，破膜劑，孵育15 min 后，加入FoxP3+單抗，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，0.5 mL PBS 重懸細胞，混勻后上機檢測外周血CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細胞含量。

1.2.5 脾臟淋巴細胞亞群檢測

取小鼠新鮮脾臟于不銹鋼網上剪碎，加入4 mL淋巴細胞分離液，用注射器活塞研磨，制備脾細胞懸液后，加入1 mL RPMI1640 培養基，2500 rpm 離心30 min，吸出淋巴細胞層，加入10 mL 1640 培養基洗滌一次，PBS 重懸細胞，每個樣本取200 μL 單細胞懸液平均加入到2 個上樣管中，一管避光標記CD3+、CD4+、CD8+單抗(按試劑說明書加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，0.5 mL PBS重懸細胞，混勻后上機檢測脾臟淋巴細胞CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞含量。一管避光標記CD4+和CD25+單抗(按試劑說明書加量)，混勻，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次，加入固定劑，破膜劑，孵育15 min 后，加入FoxP3+單抗，室溫避光孵育30 min，PBS 洗1 次后，0.5 mL PBS 重懸細胞，混勻后上機檢測脾臟CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細胞含量。

1.3 數據處理與統計方法

利用CELLQuest 軟件分析流式細胞儀上獲取的淋巴細胞亞群數據。采用SPSS 13.0 統計軟件中的one-way ANOVA 方法對實驗數據進行多重比較、差異顯著性檢驗分析。

2 實驗結果

2.1 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠體重的影響

高脂飼喂13 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠差異不顯著。高脂飼喂26 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠體重無顯著性差異。肥胖+R 組小鼠體重較肥胖小鼠有所降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1。

圖1 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠體重的影響(n=8，)Fig.1 Effects of resveratrol on the body weight of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

2.2 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響

由表2 可見，與正常小鼠相比，肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量顯著增高(P＜0.05)，HDL-C 含量較正常組有所升高，但差異不顯著(P＞0.05)。白藜蘆醇的添加可顯著降低肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量(P＜0.05)。肥胖抵抗小鼠與正常小鼠相比，其血漿TC、LDL-C 含量顯著升高(P＜0.05)，TG、HDL-C 含量較正常小鼠差異不顯著。添加白藜蘆醇對肥胖抵抗小鼠血脂無顯著性影響。

表2 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響(n=8，)Table 2 Effects of resveratrol on plasma lipid status of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

表2 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠血脂的影響(n=8，)Table 2 Effects of resveratrol on plasma lipid status of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

注:* P＜0.05，與正常小鼠比較;#P＜0.05，與肥胖小鼠比較。下表同。Note * P＜0.05 vs Control mice;#P＜0.05 vs DIO mice.Same as below.

2.3 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA 含量的影響

如圖2 可知，與正常小鼠相比，肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化能力顯著降低(P＜0.05)，肥胖小鼠脾臟MDA 含量顯著升高(P＜0.05)。白藜蘆醇的添加能夠提高肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟CAT、GSH-Px 活性及總抗氧化能力，但差異無統計學意義(P＞0.05)，肥胖+R 組小鼠脾臟MDA 含量較肥胖小鼠顯著降低(P＜0.05)。

圖2 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶活性及MDA 含量的影響(n=8，)Fig.2 Effects of resveratrol on the antioxidant enzyme activities and MDA in the spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant (DR)mice (n=8，)

2.4 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細胞亞群的影響

由表3 可見，肥胖小鼠外周血與脾臟CD3+CD4+/CD3+CD8+比值較正常小鼠顯著降低(P＜0.05)，肥胖抵抗CD3+CD4+/CD3+CD8+比值相比正常小鼠有所降低，但差異不顯著(P＞0.05)。白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血與脾臟CD3+CD4+/CD3+CD8+比值(P＞0.05)。與正常小鼠相比，肥胖小鼠外周血與脾臟Tregs 細胞含量顯著降低(P＜0.05)，肥胖抵抗小鼠脾臟Tregs 細胞含量顯著降低(P＜0.05)。白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖(P＜0.05)與肥胖抵抗(P＞0.05)小鼠Tregs 細胞含量。

3 討論

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，存在于葡萄、花生、虎杖等植物中，具有廣泛的生物學和藥理學活性。本實驗中，13 周高脂膳食引起肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠，肥胖抵抗小鼠體重與正常小鼠無顯著性差異。高脂飼喂26 周后，肥胖小鼠體重顯著高于正常小鼠，白藜蘆醇添加13 周可降低肥胖小鼠體重。TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平是反映機體脂質代謝的重要指標。長期高脂膳食引起機體血脂代謝異常，造成高脂血癥［9］。本實驗肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量顯著升高，HDL-C 含量有所升高，引起肥胖小鼠高血脂和氧化應激。肥胖抵抗小鼠血漿TC、LDL-C 含量較正常小鼠顯著升高，較肥胖小鼠有所降低。白藜蘆醇的添加可顯著降低肥胖小鼠血漿TG、TC、LDL-C 含量，從而改善血脂代謝紊亂，并且其對于肥胖小鼠的降血脂效果好于肥胖抵抗小鼠。

表3 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細胞亞群的影響(n=8，)Table 3 Effects of resveratrol on the lymphocyte subsets of peripheral blood and spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant(DR)mice(n=8，)

表3 白藜蘆醇對高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血和脾臟淋巴細胞亞群的影響(n=8，)Table 3 Effects of resveratrol on the lymphocyte subsets of peripheral blood and spleen of diet-induced obese (DIO)and diet-resistant(DR)mice(n=8，)

為了更好的維持機體穩定，人體內存在天然的抗氧化系統。CAT、GSH-Px 是兩種體內重要的抗氧化酶，正常情況下，可及時清除體內氧化代謝產物，保護細胞免受損傷，當體內氧化應激水平過高時，其活力下降，引起氧化與抗氧化之間的失衡，引發一系列代謝性疾病［10］。總抗氧化能力是對機體非酶性抗氧化能力的綜合評價指標。機體非酶系統產生的自由基可攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸產生脂質過氧化產物如MDA 等，引起細胞損傷。本實驗中肥胖與肥胖抵抗小鼠脾臟抗氧化酶CAT、GSH-Px 活性顯著下降，TAC 顯著降低，肥胖小鼠脾臟脂質過氧化物MDA 含量顯著升高。肥胖小鼠的抗氧化能力低于肥胖抵抗小鼠。肥胖與肥胖抵抗小鼠抗氧化能力降低與血脂水平升高相對應，進一步證實氧化應激/脂質過氧化參與高脂膳食誘發的血脂代謝紊亂的發生、發展。有研究表明，白藜蘆醇通過增加Mn-SOD 的含量和活性以提高高脂膳食小鼠抗氧化能力［11］。Fukui 等［12］發現白藜蘆醇選擇性的誘導線粒體SOD 的表達，進而減少線粒體的氧化應激，從而保護神經細胞免受谷氨酸鹽和過氧化氫造成的細胞損傷。本實驗中，白藜蘆醇添加對抗氧化酶及總抗氧化能力的調節作用不顯著，但能夠顯著降低肥胖小鼠脂質過氧化物MDA 含量，從而進一步證明白藜蘆醇通過緩解長期高脂膳食引起機體氧化應激，從而減少脂質沉積［13］，同時改善高脂膳食引起的肥胖小鼠血脂代謝紊亂。

長期高脂膳食誘導肥胖，伴隨著慢性炎性反應，從而損害機體免疫功能［14］。T 淋巴細胞是機體重要的免疫細胞，不同淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，可導致機體細胞免疫功能紊亂。CD3+CD4+/CD3+CD8+比值減少是免疫缺陷的重要指征。本次實驗中，高脂肥胖小鼠外周血與脾臟中CD3+CD4+/CD3+CD8+比值相比正常小鼠顯著降低，肥胖抵抗小鼠較正常小鼠差異不顯著。提示肥胖小鼠機體處于免疫抑制狀態，表明氧化應激抑制細胞免疫功能。白藜蘆醇的添加能夠提高肥胖與肥胖抵抗小鼠CD3+CD4+/CD3+CD8+比值，協調免疫細胞間的相互作用，緩解機體的免疫抑制狀態。

CD4+CD25+FoxP3+Tregs 細胞是一群抑制功能強大的T 細胞亞群，通過下調對自身或非己抗原的免疫反應，在機體免疫耐受和免疫穩態維持中起重要作用。Tregs 細胞在調節肝臟炎性反應中起重要作用，有研究表明，高脂膳食小鼠肝臟Tregs 細胞數量降低，而恢復正常膳食的同時伴隨著Tregs 細胞數量的增加［15］。Tregs 細胞還與肥胖的發生密切相關，肥胖而非肥胖抵抗小鼠脂肪組織中Tregs 細胞數量降低［16］。本實驗中，肥胖小鼠外周血與脾臟Tregs 細胞數量較正常小鼠顯著降低，肥胖抵抗小鼠脾臟Tregs 細胞數量顯著降低，外周血Tregs 細胞數量較正常小鼠差異不顯著。高脂膳食引起肥胖小鼠Tregs 細胞數量的降低進一步說明高脂膳食性氧化應激與肥胖伴隨著機體慢性炎性反應的發生。白藜蘆醇在抗炎以及抗菌方面發揮重要作用［17］。有研究發現，白藜蘆醇通過減少脂肪形成以及抗炎作用來抑制肥胖的發生［18］。本實驗中，白藜蘆醇的添加能夠增加肥胖與肥胖抵抗小鼠外周血Tregs 細胞數量，顯著增加肥胖小鼠脾臟Tregs 細胞數量，說明白藜蘆醇通過增加Tregs 細胞數量，緩解高脂膳食性氧化應激以及肥胖對機體造成的慢性炎性損傷。

高脂膳食可引起機體血脂代謝紊亂，誘發肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等一系列疾病的發生，而高脂血癥和肥胖的形成是具有慢性炎癥反應特征的病理過程，從而造成機體的免疫功能損傷。因此預防高脂膳食引起的免疫損傷是維持機體平衡、調節免疫功能紊亂的重要措施。由本實驗結果可知，高脂膳食肥胖小鼠血脂升高，誘發氧化應激，導致外周血和脾臟淋巴細胞亞群數量異常和平衡失調，機體免疫功能受損，肥胖抵抗小鼠抗氧化與淋巴細胞調節功能好于肥胖小鼠。有研究表明，高脂膳食引起機體氧化應激，誘導肝臟Tregs 細胞凋亡與炎性反應的發生［19］，說明機體的氧化還原狀態對于免疫功能調節起重要的作用。本實驗中，白藜蘆醇作為一種天然抗氧化劑能夠緩解高脂膳食對肥胖小鼠免疫功能的損傷，其原因可能是白藜蘆醇通過降低血脂，減少脂質過氧化，緩解高脂膳食對免疫細胞的氧化損傷，調節淋巴細胞亞群功能，從而改善機體免疫功能紊亂，與此同時這也為高脂膳食性肥胖引發機體免疫功能損傷疾病提供新的解決方案。

高脂飲食是導致人類和嚙齒類動物肥胖發生的重要因素，但并不能導致所有人和嚙齒類動物發生肥胖。有研究表明，高脂膳食引起肥胖而非肥胖抵抗小鼠糖代謝紊亂及內皮細胞炎性反應［20，21］，同時也有研究表明兩組小鼠血糖以及血脂水平無顯著性差異［22］。本實驗中肥胖抵抗小鼠與肥胖小鼠相比，其血脂水平無顯著性差異，但其抵抗脂質過氧化能力以及淋巴細胞調節功能好于肥胖小鼠，說明在高脂膳食情況下，肥胖抵抗小鼠相比肥胖小鼠具有較好的緩解氧化應激以及免疫功能損傷的能力。白藜蘆醇的添加對肥胖抵抗小鼠的調節作用相比于肥胖小鼠不顯著，推測兩組小鼠對于白藜蘆醇的劑量需求有所不同。因此白藜蘆醇對于高脂膳食肥胖與肥胖抵抗小鼠作用的劑量效應還有待于進一步的實驗研究。

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