駱駝刺提取物大鼠灌胃長期毒性實驗研究

魏鴻雁，竇 勤，馬曉玲，閆 明，賈曉光*

1新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002;2新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049;3新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實驗室，烏魯木齊 830049

駱駝刺為豆科植物駱駝刺莖枝Alhagi pseudoalhagi (MB)Desv.的干燥莖枝，是維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材［1］。具有清除異常膽液質(zhì)，調(diào)通機體體液的功效，主要用于大便干燥，里急后重，形瘦體弱，陽事不舉。駱駝刺含槲皮素、山奈酚、蘆丁、異黃酮木脂素等多種黃酮類、異黃酮類化合物和其他具有活性的化合物，筆者對駱駝刺提取物大鼠口服后長期毒性實驗進(jìn)行了研究，為臨床毒性反應(yīng)的監(jiān)護(hù)及生理生化指標(biāo)監(jiān)測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

駱駝刺提取物由國藥集團新疆制藥廠提供，批號:GT12001，1 g 供試品相當(dāng)于生藥22.7 g;羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethy cellulose，CMC-Na)對照品，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供，批號:100409。

1.2 動物

SD 大鼠，SPF 級，120 只，雌雄各半，體質(zhì)量140～200 g，由新疆實驗動物研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2011-0001，動物合格證號:SCXK-LAC2013-1-30。

1.3 試劑

血液生化試劑由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供;血液學(xué)試劑由希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司提供;血凝試劑由上海太陽生物技術(shù)有限公司提供;電解質(zhì)試劑由鄭州市希萊恒醫(yī)用電子有限公司提供。

1.4 儀器

7100 型全自動生化分析儀，日立公司;XT-2000iv 全自動血液分析儀，日本Sysmex 公司;S22血凝儀，深圳市鵬瑞佳電子有限公司;XR2000 電解質(zhì)儀，深圳市鵬瑞佳電子有限公司;DM2500 生物顯微鏡，德國萊卡公司;RM2235 切片機，德國萊卡公司;KD-BM 生物組織自動包埋機，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司。KD-TS3D 生物組織自動脫水機，浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司;KZPG-1A 攤片烤片機，天津天利航空機電有限公司。

1.5 試驗方法［2-4］

1.5.1 動物分組

120 只SD 大鼠檢疫1 周后，按體重隨機分為4組，每組30 只，雌雄各半，分別為對照組，低、中、高劑量藥物組。

1.5.2 劑量設(shè)計

駱駝刺膠囊，用于治療腸炎痢疾，急慢性結(jié)腸炎。每粒0.4 g，相當(dāng)于提取物0.1 g。成人每次口服一粒膠囊，每日一次，即成人每日每公斤體重提取物的擬用量為100 mg/(60 kg·d)，約為1.7 mg/(kg·d)，如果將此劑量的25 倍、50 倍和100 倍作為大鼠長毒劑量，即為42.5、85.0、170.0 mg/(kg·d)，劑量太小，不易找到樣品的安全劑量，因為就是大劑量［170.0 mg/(kg·d)］也距大鼠MTD(最大耐受量)相差甚遠(yuǎn)，僅為MTD 的千分之三十四。駱駝刺提取物小鼠的MTD 為10 g/kg，按照標(biāo)準(zhǔn)體重動物劑量折算，大鼠的MTD 約為5 g/kg。按照MTD推算，大鼠長毒高劑量一般為其MTD，中劑量為其1/3 MTD，低劑量為其1/10 MTD，高、中、低劑量分別為:5、1.6、0.5 g/(kg·d)。因供試品溶解度的限制，將高、中、低劑量設(shè)計為:3.0、1.0、0.3 g/(kg·d)。基于以上以MTD 及其溶解性推算大鼠三個劑量較為適宜。大鼠長毒三個劑量為0.3、1.0、3.0 g/(kg·d)，接近于大鼠的1/10 MTD、1/3 MTD 和MTD，分別相當(dāng)于成人每日每公斤體重擬用量的176、588、1766 倍。

1.5.3 給藥方法與觀察指標(biāo)

供試品灌胃給予大鼠，1 mL/100 g bw，每天1次，連續(xù)3 個月，空白對照組給予等量CMC-Na，每天觀察并記錄動物的外觀體征、行為活動、飲食、大便、體質(zhì)量等情況，如出現(xiàn)中毒反應(yīng)的應(yīng)重點觀察。每周稱體質(zhì)量1 次，并根據(jù)體質(zhì)量情況調(diào)整給藥量，于停藥后24 h，各組分別處死大鼠20 只，進(jìn)行全面、細(xì)致的系統(tǒng)尸檢，取腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢等稱定質(zhì)量，計算臟器器官系數(shù);對大腦、小腦、腦干、脊髓、腦垂體、胸腺、甲狀腺與甲狀旁腺、食管、唾液腺、胃、小腸、結(jié)腸、肝臟、膽囊、腎臟、腎上腺、脾臟、胰腺、氣管、肺、主動脈、心臟、附睪、睪丸、卵巢、子宮、前列腺、膀胱、視神經(jīng)、腸系膜淋巴結(jié)、胸骨骨髓等臟器，用15%中性甲醛固定，首先對高劑量藥物組和空白對照組動物標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色、光鏡檢查、觀察臟器組織病理變化。如高劑量組病理檢查結(jié)果有疑問，再進(jìn)行中、低劑量組的臟器病理學(xué)檢查。分別測定血液學(xué):紅細(xì)胞計數(shù)(red blood cell count，RBC)、血細(xì)胞比容(hematocrit，HCT)平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，RET)、血小板計數(shù)(platelet count，PLT)、血紅蛋白(hemoglobin，HGB)、平均紅細(xì)胞體積(meancorpuscular volume，MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、白細(xì)胞計數(shù)(white blood cell count，WBC-CD)、淋巴細(xì)胞數(shù)目(lymphocytes，LYMPH)、單核細(xì)胞計數(shù)(monocyte count，MC)、粒細(xì)胞計數(shù)(granulocyte count，GRAN)、凝血酶原時間(prothromvin time，PT)和血液生化學(xué)指標(biāo):ALT、AST、ALP、BUN、Cr、TP、ALB、TC、Glu、T-Bil、CK、TG、K+、Na+、CL-。剩余大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)2 周，同樣進(jìn)行上述觀察和檢測。通過上述觀察和檢測，以了解大鼠在給藥期間的毒性反應(yīng)及停藥后一段時間內(nèi)的恢復(fù)情況。

1.5.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果

2.1 一般狀況觀察、體質(zhì)量及進(jìn)食量

試驗期間，各組動物行為活動未出現(xiàn)異常，高劑量雄性大鼠連續(xù)11 周出現(xiàn)體重下降，高劑量雄性大鼠連續(xù)3 周出現(xiàn)進(jìn)食量增多，見圖1。

圖1 駱駝刺提取物大鼠灌胃3 個月長期毒性試驗中雄性(A)及雌性(B)動物體重變化圖Fig.1 Effects of A.pseudoalhagi extract on male (A)and female (B)body weight of rats by 3 months medication

2.2 臟器重量和臟器系數(shù)

表1 駱駝刺提取物大鼠灌胃長毒試驗給藥3 個月血液學(xué)數(shù)據(jù)分析(x±SD，n=10)Table 1 The effects of A.pseudoalhagi extract on haematological indexes of rats after 3 months medication (x±SD，n=10)

表2 駱駝刺提取物大鼠灌胃3 個月長期毒性試驗(恢復(fù)期)血象數(shù)據(jù)分析(x±SD，n=5)Table 2 The effects of A.pseudoalhagi extract on haematological indexes of rats after withdrawing medication for 15 days (x±SD，n=5)

表3 駱駝刺提取物大鼠灌胃長毒試驗給藥3 個月血生化數(shù)據(jù)分析(x±SD，n=10)Table 3 The effects of A.pseudoalhagi extra ct on blood biochemical indexes of rats after 3 months medication (x±SD，n=10)

注:與對照組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note :Comparedwith blank controlgroup，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

表4 駱駝刺提取物大鼠灌胃3 個月長期毒性試驗(恢復(fù)期)血生化數(shù)據(jù)分析(x±SD，n=5)Table 4 The effects of A.pseudoalhagi extract on blood biochemical indexes of rats after withdrawing medication for 15 days (x±SD，n=5)

2.3 血液學(xué)檢查

與對照組比較，末期高劑量組LYMPH(♀)、中劑量組NEUT、中、高劑量組RBC(♀)、中劑量組(♀)HGB、高劑量組(、♀)PLT 升高(P＜0.05);高劑量組(♀)NEUT 顯著降低(P＜0.01);恢復(fù)期中、高劑量組WBC(♀)、HGB、HCT 降低(P＜0.05)，見表1、2。

2.4 血生化指標(biāo)和電解質(zhì)檢查

2.5 大體解剖檢查

給藥結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束對大鼠進(jìn)行解剖，各組動物大體解剖檢查肉眼未見臟器異常。

2.6 組織病理學(xué)檢查

綜合給藥結(jié)束、恢復(fù)期結(jié)束組織病理學(xué)觀察，高劑量組可見肺間質(zhì)淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，大腸、前列腺黏膜下淋巴細(xì)胞浸潤或有炎癥，肝細(xì)胞點狀壞死等病理變化，腎臟蛋白管型，這些病理改變在對照組的動物中也有發(fā)現(xiàn)，且與給藥組比較病變數(shù)量及程度未見明顯差異，同時病變范圍小、程度輕，符合SD 大鼠常見自發(fā)性病變，故考慮與藥物作用無關(guān)。在本次實驗條件下，未發(fā)現(xiàn)明顯藥物相關(guān)性病理改變，亦無明顯靶器官。

3 討論

駱駝刺提取物0.3、1.0、3.0 g/(kg·d)，分別相當(dāng)于生藥量6.8、22.7、68.1 g/(kg·d)，接近于大鼠的1/10 MTD、1/3 MTD 和MTD，分別為臨床成人每日每公斤體重擬用量的176、588、1766 倍，連續(xù)灌胃大鼠3 個月，一般癥狀表現(xiàn)為給藥組大鼠隨著劑量的增加，高劑量組雄性大鼠出現(xiàn)連續(xù)體重下降，進(jìn)食量短暫增加，表明駱駝刺提取物對大鼠的體重和進(jìn)食量均有一定影響，尤其對雄性體重影響更為顯著，在選定安全劑量時應(yīng)預(yù)考慮［5］。

血液學(xué)、血生化、電解質(zhì)檢查結(jié)果中，偶有數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常，多為一個劑量所為，變化無劑量規(guī)律性，且變化差值很小，數(shù)據(jù)無病理意義。組織病理學(xué)檢查:肺臟、大腸、肝臟、腎臟、前列腺有輕度炎癥或細(xì)胞浸潤，對照組和給藥組各組間臟器病變例數(shù)差異不大，認(rèn)為為動物自身病變，而非藥物毒性所致，其余臟器未見明顯病理變化。在本次實驗條件下無顯著的藥物關(guān)連性毒性靶器官。綜上所述，在本次實驗條件下，駱駝刺提取物對SD 大鼠無明顯的藥物關(guān)連性毒性靶器官，駱駝刺提取物對大鼠的未見明顯毒性反應(yīng)劑量為1.0 g/(kg·d)［相當(dāng)于生藥22.7 g/(kg·d)］。相當(dāng)于成人每日每公斤體重擬用量［1.7 mg/(kg·d)］的588 倍。

1 Iksakjan Mahmut(易沙克江·馬合穆德).Encyclopedia of Chinese Medicine-Uyghur Medicine(中國醫(yī)學(xué)百科全書-維吾爾醫(yī)學(xué)).Shanghai:Publishing House of Science Technology of Shanghai，2005.302 -303.

2 Yuan BJ(袁伯俊)，Liao MY(繆明陽)，Li B(李波).Drug Toxicological Method and Technic (藥物毒理學(xué)實驗方法與技術(shù)).Beijing:Publishing House of Chemical Industry，2007.1，200-210.

3 Xu SY(徐叔云)，Bian RL(卞如濂)，Chen X(陳修).Pharmacological Method，Third edition (藥理實驗方法學(xué)，第3版).Beijing:Publishing House of Public Health，2003.226 -229.

4 Yisilamu R(熱比姑麗·伊斯拉木).The long-term toxicity of Datura stramonium L seeds of Xinjiang and its preparation Habbixipa pills on rats.Chin Pharmacol Bull (中國藥理學(xué)通報)，2011，27:1479-1480.

5 Xie XQ(謝秀瓊).Chinese medicine for new agents in development and application.(中藥新制劑開發(fā)與應(yīng)用)，Beijing:Publishing House of Public Health，2002.527-535.