丁岙楊梅揮發油成分及抗腫瘤活性的研究

劉 濤，金吉林，金吉芬，彭志軍，羅福賢

貴州省農業科學院果樹科學研究所，貴陽 550006

楊梅(Myricarubra Sieb.et Zucc)為楊梅科楊梅屬亞熱帶常綠果樹，原產我國東南部，以浙江、江蘇、福建等省為主要產區［1-4］。楊梅果鮮汁旺、風味獨特、營養豐富［5，6］。作為我國的傳統特產水果，楊梅色澤鮮艷、汁液多，營養價值高，風味獨特，能生津解渴，助消化，浸酒。中醫認為，楊梅性溫味甘酸，具有生津止渴、和胃調食、行氣止痛的功效［5］。《本草綱目》中記載:“楊梅味酸甜，性溫、無毒。能止渴、和五臟、滌腸胃，除煩潰惡氣”［7］。《開寶本草》中記載:楊梅“主去痰、止嘔、斷下痢，清食解酒”［3］。果實中主要含有葡萄糖、果糖、維生素﹑蛋白質、檸檬酸等［8］，楊梅中的微量營養元素主要包括花青素和多酚類，這兩類物質對于楊梅的營養、感官、生物活性、商業價值均具有重要的意義，其中多酚類化合物主要有:對羥基苯甲酸類(食子酸、原兒茶酸等)、黃酮類(槲皮素、楊梅黃酮等)、鞣質(水解鞣質、縮合鞣質)等［9］。在溫州市茶山鎮大羅山上，滿山是清一色的楊梅樹，稱茶山“丁岙梅”。王賢親等采用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對丁岙楊梅葉的揮發油化學成分進行了分析［10］，而目前對于丁岙楊梅果實揮發油化學成分的研究尚未見報道。本文以水蒸氣蒸餾法提取其揮發性成分，采用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對其化學成分進行分析鑒定，同時研究了丁岙楊梅揮發油的抗腫瘤生物活性，為其質量全面評價提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

丁岙楊梅果實由貴州省荔波縣甲良楊梅基地提供，于2013年6 月采摘同株樹上成熟度一致的果實，剔除爛果。RPMI 1640 培養基(美國GIBICO 公司);胰蛋白酶(美國SIGMA 公司);胎牛血清(天津市灝陽生物制品科技有限公司);MTT(北京鼎國生物技術發展有限公司);SDS(北京鼎國生物技術發展有限公司)。

1.2 儀器與設備

ISQ 型氣相色譜-質譜聯用儀(美國Thermo 公司);YXQ-LS-50 滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);XW-80A 旋渦混合器(上海精科實業有限公司);CO2培養箱(日本SANYO 公司)。

1.3 供試細胞

胃癌細胞株MGC-803、乳腺癌細胞株MCF-7 以及肺癌細胞株A549 購自中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取

將新鮮的丁岙楊梅去皮及其籽，陰涼處風干后，粉碎。將粉末35 g 放入1 L 燒瓶中，加水200 mL 和數粒玻璃珠，連接揮發油測定器和回流冷凝管，在電熱套中進行提取，等沸騰后保持微沸4 h，直至揮發油不再增加為止。提取結束后，將揮發油提取器下端的水相除去，收集黃色油層，再用無水硫酸鈉干燥備用。

2.2 氣相色譜條件

氣象色譜HP-5 MS 5% phenyl Methyl Siloxane(0.25 μm×0.25 mm×30 m)彈性石英毛細管柱，柱溫以50 ℃起并以5 ℃/min 升溫到280 ℃，保持10 min;汽化室溫度為250 ℃，載氣為高純 He(99.999%)，載氣流量為1.5 mL/min，進樣量為1 μL(用將樣品稀釋的溶液)，不分流。

2.3 質譜條件

離子源為EI 源，離子源溫度為280 ℃，電子能量是70 eV，接口溫度為280 ℃，溶劑延遲2 min，質量范圍m/z 40～550。所得質譜圖通過HPMSD 化學工作站，結合Nist 5 標準質譜圖庫，根據有關文獻進行人工檢索解析鑒定樣品中化學成分的質量分數，結果見表1。

2.4 抗腫瘤活性測試

將96 孔板的上、下行用滅菌二次水封邊，每孔200 μL。取對數生長期細胞，胰酶消化后，重懸于含10% FBS 的RPMI 1640 培養基中，以2 ×104cells/mL 的終濃度接種于96 孔培養板，每孔100 μL，最右側一列為空白對照組，加無細胞的有血清RPMI 1640 培養基。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養24 h 使細胞貼壁。吸掉培養基，加入含不同藥物濃度的有血清培養基，每孔200 μL，注意培養基中DMSO 終濃度不能超過0.1%，空白對照組每孔加200 μL 完全培養基。分別處理實驗要求時間，去除上清，加100 μL/well 濃度0.5 mg/mL 的MTT。培養4 h 后再補加100 μL/well 的10% 的SDS。37 ℃下10 h 使結晶物充分溶解后取出，微震蕩5 min，放置室溫下30 min，在A595波長下測OD值，并計算細胞活性、抑制率和P 值［11-13］。以藥物濃度或處理時間為橫軸，OD 值或者抑制率為縱軸，繪制曲線。每樣本濃度重復六個孔，每個實驗重復三次，取平均值為最終結果。實驗結果以SPSS 軟件進行方差分析，P＜0.05 時為差異顯著，P＜0.01 時為差異極顯著，實驗結果如圖1 所示。細胞增殖的抑制率計算公式如下:

表1 丁岙楊梅果實揮發油的成分及相對含量Table 1 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in M.rubra

圖1 丁岙楊梅果實揮發油對腫瘤細胞抑制率Fig.1 The inhibitory effects of volatile oil on different tumor cell lines in vitro

3 討論

本文使用水蒸氣蒸餾法從丁岙楊梅果實中提取揮發油，通過氣相色譜-質譜聯用方法對其進行化學成分分析。如圖1 所示，從丁岙楊梅果實揮發油中分離得到33 個峰，鑒定出了其中的27 個化合物，已鑒定的化合物占總組分的92.37%，其主要成分為:石竹烯(20.80%)、鄰苯二甲酸己烷-3-醇異丁醇酯(9.73%)、棕櫚酸(26.55%)、2，2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(6.55%)、鄰苯二甲酸二異辛酯(4.23%)、β-谷甾醇(3.23%)等。本文與文獻［10］分析得出的丁岙楊梅葉揮發油化學成分有較大差異，丁岙楊梅葉的主要化學成分為石竹烯(49.79%)、α-石竹烯(24.16%)、橙花叔醇(16.59%)、石竹烯氧化物(2.21%)等。可見，丁岙楊梅果實及其葉揮發油的主要化學成分除石竹烯外其它化學成分的鑒定結果不盡相同，且化學成分的含量差異也較大。

此外，本文使用MTT 法測定了丁岙楊梅果實揮發油對腫瘤細胞MGC-803、MCF-7 和A549 體外增殖的抑制作用。如圖2 測定結果表明，丁岙楊梅果實揮發油表現了較好的抗腫瘤活性，在質量濃度為200 μg/mL 時對腫瘤細胞MGC-803、MCF-7 和A549體外增殖的抑制率分別為57.3%、42.0% 和42.4%。如圖1 所示，其抑制作用并呈現濃度依賴性，隨著濃度的變大，對三種細胞的體外增殖的抑制活性呈現增加的趨勢。

丁岙楊梅果實揮發油化學成分較為復雜，含有大量的有機酸、酯、萜、酚、甾體、烷烴等，含有少量的醛類化合物，從而構成其特有的藥用價值，對這些化學成分的提取分離和純化以及利用還有待于深入研究，以實現對丁岙楊梅的深層次開發利用。

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