響應曲面優化喜樹生物堿醇提工藝研究

余響華，蔣瓊鳳，邵金華

湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室 湖南科技學院，永州 425100

喜樹(Camptotheca acuminata)又名旱蓮、水栗、水桐樹、旱蓮子、野芭蕉等，屬藍果樹科(Nyssaceae)、喜樹屬(Camptotheca)，為我國特有植物，主要分布于長江以南地區［1］。喜樹中含有顯著、廣譜抗腫瘤活性［2］的生物堿物質-喜樹堿(camptothecin，CPT)，它能夠穩定拓撲異構酶I-DNA 裂解復合物，使之轉變為細胞毒素DNA 的雙鏈裂解，最終導致細胞死亡［3］。CPT 是迄今為止發現的唯一通過抑制拓撲異構酶I 發揮細胞毒性的天然植物活性成分［4］。由于喜樹堿本身具有較大毒性，不能直接用于臨床治療，較為可行的是以喜樹堿為前體原料，通過合成高效低毒的衍生物以獲得新的抗癌藥物［5］。目前美國食品和藥物管理局(FDA)已批準4 種喜樹堿衍生物CPT-11、TPT、9-AC、9-1NC 用于治療結腸/直腸癌及卵巢癌［6，7］，開發出的CPT 衍生物已成為繼紫杉醇后的又一類重要抗癌新藥。因此，對當今抗癌新藥的原料藥-喜樹堿的研究仍具有十分重大的現實意義。

不同地區喜樹中喜樹堿含量差異性較大，湖南產喜樹果中CPT 在0.9%左右［8，9］。本研究以湖南產喜樹果為原材料，運用Design-Expert 7.0 軟件，建立正交實驗組，通過對實驗結果的分析優化，建立了喜樹堿乙醇提取的最佳工藝條件，為喜樹堿的規模化生產提供實驗參考。

1 材料與儀器

喜樹果，2013年11 月采摘自湖南永州，根據《中國植物志》的描述，結合咨詢2 位具有天然植物有效成分(藥用)方面的博士(姜紅宇、劉小文)，鑒定為喜樹果(Camptotheca acuminate fruit)，曬干后4℃低溫貯藏。

喜樹堿標準品(純度＞98%，上海純優生物，批號:P0281)、甲醇(色譜純)，氯仿、95%乙醇、無水乙醇、甲醇、NaOH、鹽酸均為AR 級;

主要設備與儀器:粉碎機、TG21KR 離心機、日本島津LC-10ATvP 高效液相色譜儀、Kromstar C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、予華儀器HH-WO 型旋轉蒸發儀、HASUC DZF-6030 型真空干燥箱。

2 實驗方法

2.1 工藝流程

干燥、粉碎→乙醇回流浸提→減壓濃縮得浸膏→氯仿提取→減壓濃縮→甲醇回流提取→過濾，得不溶物→NaOH 溶解→離心，收集濾液→調酸→加甲醇，保溫析出→抽真空干燥→定容→HPLC 檢測。

2.2 原料及提取液的處理

2.2.1 原料的前處理

將采集到的喜樹果實經60 ℃低溫干燥，控制水分在5%以下，粉碎過20 目篩，備用。

2.2.2 乙醇浸提流程

準確稱取20.0 g 喜樹果粉末，按一定的料液比加入乙醇溶液回流浸提，收集浸提液，減壓濃縮得浸膏，加200 mL 氯仿震蕩提取，旋轉蒸發儀減壓濃縮，回收氯仿，干物質經200 mL 甲醇回流提取，抽真空過濾，用50 mL 2.5 mol/L 的NaOH 震蕩溶解濾渣部分，6500 rpm 離心5 min，取上清液，2.0 mol/L HCl調酸至pH 2.0～3.0，加200 mL 的甲醇震蕩析出喜樹堿，旋轉蒸發儀60 ℃蒸發至干，加甲醇(色譜級)溶解，定容于100 mL 容量瓶中，備用，HPLC 檢測。

2.3 喜樹堿含量的測定

2.3.1 標品溶液配制

精確稱取喜樹堿標準品1.0 mg，用10 mL 色譜級甲醇溶解，配成100 mg/L 母液備用。將母液稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、40.0 mg/L 的系列標準品溶液。

2.3.2 HPLC 條件

流動相:甲醇∶水(v/v)=60∶40;流速1.0 mL/min，檢測波長254 nm［10］，柱溫25 ℃，進樣量10μL。

2.3.3 樣品喜樹堿含量的測定

按上述色譜條件，吸取10 μL 樣品溶液，上HPLC 儀檢測。測得數據代入標準曲線回歸方程，得樣品喜樹堿濃度，喜樹堿含量按下式計算:

式中，C 為樣品喜樹堿濃度(mg/L)，V 為樣品定容的體積(mL)，M 為稱取樣品質量(g)。

2.4 乙醇浸提喜樹堿單因素實驗

設定其它條件不變的情況下，分別考察液料比、乙醇濃度、提取溫度和提取時間對喜樹堿得率的影響(表1)。

表1 喜樹堿乙醇提取單因素變化條件Table 1 Condition of single factor experiments for ethanol extraction

2.5 響應面實驗設計

依據單因素實驗結果，選取對喜樹堿提取率有顯著影響的3 個因素:料液比、乙醇濃度、提取時間，利用正交實驗結合Design-Expert 7.0 軟件分析上述3 個因索在3 個水平上對喜樹堿提取效果的影響，實驗設計如表所示。

表2 響應面實驗因素與水平Table 2 Factors and levels of RSM experiment

圖1 喜樹堿標準品(A)及樣品(B)HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of camptothecin standard (A)and sample (B)

3 結果與分析

3.1 喜樹堿含量測定

將標準喜樹堿溶液和分離純化后的樣品溶液上HPLC 儀器檢測，所得圖譜如下:

結果表明，喜樹堿標準品的保留時間為7.492 min(圖1A);喜樹堿濃度(mg/L)X 與峰面積(uv·s)Y 的線性回歸方程為:Y=16713X -20674，R=0.9994，表明喜樹堿在5.0～40.0 mg/L 范圍內具有良好的線形關系;樣品(圖1B)在7.502 min 處出峰，且與其它組分達到基線分離，證明提取物中含有喜樹堿。

3.2 乙醇浸提喜樹堿單因素實驗結果

3.2.1 乙醇濃度對喜樹堿提取效率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比分別加入80%、85%、90%、95%、100%的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經純化后測定喜樹堿濃度，得乙醇濃度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(A)。結果表明，提高乙醇濃度有利于喜樹堿的浸出，當乙醇濃度超過90%，得率反而降低，100%時提取效率最低，僅有0.375‰。水的存在有利于喜樹果粉末有效成分的溶出，提高乙醇濃度可增加喜樹堿提取率，在90%時達到最大值，因此選擇90 %的乙醇溶液為浸出最優濃度。

3.2.2 液料比對喜樹堿提取的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 的液料比加入90 %的乙醇40 ℃浸提2.0 h，經純化后測定喜樹堿濃度，得料液比與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(B)。結果顯示，隨著提取溶劑用量的增加，喜樹堿含量也相應提高，但增幅隨溶劑用量的增加而減緩，當濃縮比超過1∶20 后，喜樹堿的得率保持不變，為節省溶劑及回收溶劑的能耗，選擇最佳液料比為20∶1。

3.2.3 提取溫度對喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 的液料比加入90%的乙醇，分別于20、30、40、50、60 ℃浸提2.0 h，經純化后測定喜樹堿濃度，得提取溫度與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(C)。

結果顯示，在20～40 ℃提取范圍內，隨著溫度升高，喜樹堿得率緩慢增加，但增勢不明顯，僅為0.84%;40 ℃至60 ℃時則基本無變化，說明在40～60 ℃范圍內，溫度對提取效率影響不顯著，因此喜樹堿乙醇提取溫度宜控制在40 ℃，后續實驗不再考查溫度因素。

3.2.4 提取時間對喜樹堿提取率的影響

取喜樹果粉末20.0 g，按20∶1 液料比加入90%的乙醇，40 ℃下分別浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，經純化后測定喜樹堿濃度，得提取時間與喜樹堿含量變化曲線，如圖2(D)。

由圖可知，浸提時間對喜樹堿的得率有較大影響，提取時間越長，喜樹堿得率越高。考慮到提取時間過長將延長提取周期，且會增加喜樹堿發生氧化概率，進而降低喜樹堿提取效率，因此選擇浸提時間2.0 h 為宜。

圖2 乙醇濃度(A)、液料比(B)、溫度(C)及時間(D)對喜樹堿提取效率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration (A)，liquid:solid ratio (B)，temperature (C)and time (D)on the extraction yield of camptothecin

3.3 響應面實驗結果與分析

3.3.1 響應面實驗結果

對影響提取得率較大的液料比、乙醇濃度、提取時間3 因素作3 水平的響應面正交設計實驗，所得結果見表3。

表3 響應面實驗結果Table 3 Results of RSM experiments

3.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗

對上述實驗結果進行響應曲面分析，所得方差分析如表4 所示。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 ANOVA of regresion models

利用Design-Expert 7.0 對表2 試驗數據進行多元回歸擬合，得到生物堿提取率(Y)對乙醇體積分數(A)、液料比(B)、時間(C)的二次多項回歸模型為:Y=-12.2613+0.26399A+6.795 × 10-3B +1.20095C+1.7 ×10-4AB-5.9 ×10-3AC-3.2 ×10-3BC-1.438 × 10-3A2-3.48 × 10-4B2-0.1368C2，R2=0.9998，表明擬合情況良好，回歸方程模型可行。

方差分析結果表明，各因素與響應值之間線性關系顯著:回歸模型F 值=87.72，P＜0.0001，表明二次多元回歸模型極其顯著;失擬F 值=4.72，P=0.0839＞0.05，模擬失擬不顯著;模擬的整確定系數R2=0.9998，說明該模型擬合程度比較好，實驗誤差小，適合用于對喜樹生物堿提取進行分析和預測。

圖3 3 因素交互作用對喜樹堿提取率影響的響應面圖(B-C、A-C、A-B)Fig.3 Response surface plots showing the cross interaction among three factors (BC，AC，AB)

圖4 分別表示在固定乙醇濃度90%、液料比20∶1(mL/g)和醇提時間2.0 h 的條件下，液料比-時間(B-C)、液料比-時間(A-C)、乙醇濃度-液料比(AB)3 因素交互作用對提取率的影響。結果顯示，A、B、C 三者交互作用顯著。對回歸方程進行一階求導，得3 元一次方程:0.26399-0.00017B-0.0059C-0.002874A=0;0.006795-0.00017A-0.0032C-0.00696B=0;1.20095-0.0059A-0.0032B-0.2736C=0。求解方程得到最佳提取條件為:乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時間2.23 h，按照上述條件補做驗證性實驗，結果顯示喜樹堿提取率提高至0.847 mg/g(干重)，較單因素最佳提取工藝提高了3.42%，優化效果顯著。

4 結論

依據單因素實驗結果，采用響應面正交實驗法對喜樹生物堿3 個影響因素進行分析，確定最佳提取工藝為乙醇濃度88.53%，液料比21.4∶1(mL/g)，時間2.23 h，此時喜樹生物堿提取率可達到0.847 mg/g(干重)。本研究首次采用響應面正交實驗的方法對湖南產喜樹生物堿提取工藝進行了優化。本研究為實現喜樹中特殊成分-喜樹堿提取效率的提高，進一步開發利用喜樹這一重要藥用植物提供了重要的實驗依據，為喜樹堿的提取工藝提供了又一科學合理，準確可靠的實驗數據。

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