漢麻提取物的抗紫外功效篩選和安全性評價

何聰芬，李靖宇，王 領，何錦風

1北京工商大學北京市植物資源研究開發重點實驗室;2首都師范大學生命科學學院，北京 100048;3東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030;4總后勤部軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心，北京 100082

漢麻(China-hemp)是大麻科(Cannabinaceae)蕁麻目(Urticales)大麻屬(Cannabis)大麻種(Cannabis sativa L.)的1年生草本植物［1］。漢麻的抗紫外輻射功能在所有麻類中是最好的，能有效減少紫外線對人體的危害［2-4］。任漢陽［5］的研究表明漢麻籽油可以提高SOD、GSH-Px 等酶的活力，進而發揮抗氧化、延緩衰老的作用;曹俊嶺［6］的研究證明漢麻籽油可通過抗氧化作用和對NO 的影響起到延緩衰老的作用，漢麻籽油中的多不飽和脂肪酸具有較強穿透皮膚的能力，可作為洗滌品和護膚用品的原料。漢麻籽油消除DPPH·自由基的能力超過橄欖油［7］，并在200～420 nm 有強吸收峰，能夠吸收波長320～400 nm 的UV-A 和波長275～320 nm 的UVB［8-10］，適合用作抗氧化和抗紫外功效化妝品的原料。雖然漢麻擁有優秀的抗紫外功能，但在國內外尚未見對漢麻不同生長階段、不同部位的抗紫外作用的評價及比較的相關報道。本實驗對不同時期、不同部位的漢麻提取物進行了抗紫外功效篩選，根據最佳提取物主要功效成分的含量進行提取工藝優化、并對提取物的安全性及穩定性進行了初步研究。本研究可為漢麻在化妝品中的開發應用提供有價值的科學數據，進而為抗紫外產品的工業化生產提供原料制備方面的重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

漢麻“云南一號”，中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所軍用漢麻材料研究中心提供。

無水乙醇、乙酸乙酯、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、葡萄糖、檸檬酸三鈉、檸檬酸、鹽酸氯丙嗪、氫氧化鈉、濃鹽酸、對-二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、冰乙酸、乙酸鈉結晶、無水氯化鈣、DPPH、SDS、濃硫酸、苯酚、蘆丁、Al(NO3)3、Folin-酚試劑、NaNO2、結晶牛血清蛋白、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅等，均購自北京化學試劑公司。

RE-52AA 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;JA-5300 電子分析天平，上海精密科學儀器公司;DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司;RJ-LD-IIB 低速大容量多管離心機，無錫瑞江分析儀器有限公司;UV2300 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;NIKON SMZ1000 解剖顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 漢麻提取物的制備

針對漢麻(以下簡稱hemp)不同生長期(40、80、120、160 d)的莖(稈)、葉、皮、根分別采用以下方法進行提取:水熱浸提法、60%乙醇提取法、95%乙醇提取法、乙酸乙酯提取法(干物料粉碎后過30 目篩，料液比1∶15 混合，微沸1 h，4000 rpm 離心15 min，取上清，抽濾至澄清后烘干)、水提醇沉法(干物料粉碎后過30 目篩，料液比1∶15 混合，微沸1 h，4000 rpm 離心15 min，取上清，濾液加入3 倍體積乙醇過夜，8000 rpm 離心10 min，取沉淀，冷凍干燥)。

1.2.2 抗紫外功效評價

1.2.2.1 紫外線掃描檢測

將各提取物用相應溶劑稀釋成每毫升相當于生藥0.5 mg，以相應溶劑為空白對照，在200～400 nm波長范圍內進行掃描，確定提取物在各波長的透光率［11］。計算方法:先計算各提取物在UV-B 區的280、290、300、310、320 nm 和UV-A 區的320、330、340、350、360、370、380、390、400 nm 的平均透光率，再換算成平均紫外線吸收率。

1.2.2.2 清除DPPH·自由基試驗

分別取等體積的待測液與DPPH·溶液(2 ×10-4mol/L)(A1管)、等體積的無水乙醇與DPPH·溶液(2 ×10-4mol/L)(A2管)、等體積的無水乙醇與待測液(0.05～3 mg/mL)(A3管)混勻，反應30 min后，測量A1、A2、A3管在517 nm 的吸光值，計算:DPPH·自由基清除率(%)=［(A2+A3)-A1］/A2。根據清除率(%)的線性擬合方程求出IC50值［12］。該試驗的陽性對照是抗壞血酸Vc。

1.2.2.3 光溶血試驗

將采集的雞血液樣本在室溫下1500 rpm 離心15 min，棄去上清液，用等量PBS 緩沖液混洗離心管中的紅細胞，添加適量葡萄糖至1 ×10-2mol/L，4 ℃密封保存。吸取1 mL 雞血細胞，用PBS 緩沖液稀釋至25 mL，再進一步十倍稀釋成紅細胞懸液。取兩塊6 孔細胞培養板，在各孔中加入1 mL 該紅細胞懸液、1 mL 的PBS 緩沖液和1 mL 氯丙嗪溶液(1 mg/mL)，并在其中一塊板中添加不同濃度的待測液(0.1、0.3 mg/mL)。這兩塊培養板靜置10min 后，同時置于紫外燈下照射。保持照射功率不變，每照射一定時間后觀察紅細胞的光致溶血反應，計算:溶血率(%)=［(照射后樣品-未照射樣品-無紅細胞樣品)/(100%溶血值-未照射樣品)］×100［13］。

1.2.3 提取工藝的優化

稱取7 份(每份2 g)粉碎后過30 目篩的漢麻(160 d)葉，分別加入20、30、40、50、60、70、80 mL 去離子水，配成料液比為1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1∶30、1∶35、1∶40 的混合液，均勻攪拌后浸提，烘干后衡量，比較料液比對提取率的影響。

料液比1∶20，70 ℃浸提，設浸提時間分別為1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，烘干后衡量，比較提取時間對提取率的影響。

料液比1∶20，設浸提水浴溫度分別為65、70、75、80、85、90 ℃，烘干后衡量，比較提取溫度對提取率的影響。

料液比1∶20，75 ℃浸提，設合并浸提液的次數分別為1 次、2 次、3 次，烘干后衡量，比較提取次數對提取率的影響。

1.2.4 提取物的化學成分分析

參照QB/T 2488-2007，采用苯酚-硫酸法、Folin-酚法和NaNO2-Al(NO3)3比色法分別測定漢麻提取物中的總糖、總蛋白和總黃酮含量。

1.2.5 提取物的安全及穩定性檢測

安全性檢測:紅細胞溶血試驗［14］及雞胚絨毛尿囊膜試驗(SN/T2329-2009)。

穩定性檢測:測定1% 提取物溶液的自身pH值。將提取物分別用HCl 和NaOH 液配制成pH 1～14 的溶液(濃度為5.0 %)，靜置0.5、3、24 h 后，觀察提取物狀態，分析其pH 穩定性。

將1%提取物溶液分成12 等份(每份40 mL)于無色透明樣品瓶中，編號1～12，置于4 ℃冰箱中。分別于第1、2、3、4、5 d、第1、2、3 周和1 個月后測定提取物溶液的各種指標參數變化(包括顏色、氣味，是否出現沉淀，pH 值、粘度和活性物含量變化等)。當提取物溶液第一次出現明顯異常(以上任意一項指標變化均屬異常現象)時，繼續實驗至下一個時間點后結束試驗，分析原因。

重復相同步驟，配制1～12 號樣品置于溫度40℃的烘箱，分析其耐熱穩定性;或交替置于冰箱(溫度4 ℃)和烘箱(溫度40 ℃)中，分析其冷熱交替穩定性;或置于陽光直射處，分析其光穩定性。

2 實驗結果

2.1 抗紫外功效評價

2.1.1 紫外光譜掃描結果

不同部位漢麻提取物的平均紫外線吸收率見表1。相對于漢麻(160 d)皮提取物，漢麻(160 d)葉的乙醇提取物、水提醇沉物和乙酸乙酯提取物的平均紫外吸光率較大，且在UV-A 和UV-B 兩個波段均有較強的吸收。因此，初步認為漢麻葉比漢麻皮的提取物更具有抗紫外功效的開發價值。

表1 不同部位漢麻提取物的平均紫外線吸收率Table 1 The average UV absorbance of extracts from different parts of China-hemp

2.1.2 清除DPPH·自由基試驗結果

不同生長期、不同部位的漢麻提取物對DPPH·清除能力見表2，從表中可知，隨著濃度(0.05～3.6 mg/mL)的增加，不同生長期、不同部位漢麻乙醇提取物對DPPH·自由基的清除能力均逐漸增強，呈顯著的直線相關(R2=0.981～0.998)。在半抑制濃度(IC50)的比較中，A 組和B 組提取物IC50值較低，分別為2381.9 μg/mL 和2583.7 μg/mL。IC50值越低，說明樣品清除DPPH·自由基的能力越強［15］。因此，初步判斷生長期160 d、漢麻葉的乙醇提取物相對于120 d 生長期和其它提取部位(皮)具有更好的DPPH·自由基清除作用，且漢麻(160 d)葉60%乙醇提取物優于漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物。

表2 不同生長期、不同部位的漢麻提取物對DPPH·清除能力Table 2 DPPH· scavenging ability of China-hemp extracts of different stages and different parts

2.1.3 光溶血試驗結果

在光溶血試驗中(表3)，不同生長期漢麻葉95%乙醇提取物的添加(0.1 mg/mL 或0.3 mg/mL)使1h 后紅細胞溶血率下降了42%～63%，說明這幾種提取物能有效阻止紫外線照射對紅細胞造成的損傷。其中，160 d 漢麻葉提取物的溶血率下降幅度最大。

通過以上紫外掃描檢測、清除DPPH·自由基試驗和紅細胞光溶血試驗，分別對不同生長期、不同部位漢麻提取物的紫外吸收能力、抗氧化能力和防紫外損傷能力的分析和比較，發現漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的綜合抗紫外功效最優，并對其進行下一步的提取工藝優化研究。

注:光溶血體系中添加1 mg/mL 鹽酸氯丙嗪溶液1 h 后，紅細胞溶血率達到92.3%。Note:After adding 1 mg/mL of chlorpromazine hydrochloride solution to the photohemolysis system for 1h，the red blood cell hemolysis rate reached 92.3%.

2.2 提取工藝優化結果

本實驗分別從料液比、提取時間、提取溫度、提取次數四方面確定漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的工藝優化參數。

圖1 料液比對漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yield of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖1 可知，隨著料液比的升高，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率先升后降，但總體變化不大。當料液比達到1∶30 時，得率不再增加反而略有所下降，可能是可溶性雜質溶出量增大，降低了得率，同時溶劑用量過大也會延長濃縮時間，造成黃酮類物質的部分分解［16］，并給后序處理增加困難。因此，在保證提取效果的同時，選定料液比為1∶20。

圖2 提取溫度對漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of 95%ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖2 可知，隨著溫度的升高，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率也是呈現先升后降的變化。主要原因為，溫度升高導致提取液黏度減小，擴散系數增加，促使提取速度加快;但溫度過高時，雜質溶出量也相應增大［4］，活性成分易被破壞，溶劑損失量增大，提取效果反而下降。因此，選擇提取溫度為75 ℃。

圖3 提取時間對漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.3 Effects of extraction duration on the yield of 95%ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖3 可知，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的得率在提取時間在2.5 h 時達到最高，然后隨著提取時間的延長反而下降。這可能是由于長時間的提取，造成了黃酮類物質的部分分解［17］，以致提取效果下降。考慮到提取效果和縮短生產周期的需要，選定提取時間為2 h。

圖4 提取次數對漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物得率的影響Fig.4 Effects of times of extraction on the yield of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

由圖4 可知，一次提取的得率約為10.43%，而二次提取得率僅為2.0%左右，說明提取1 次漢麻(160 d)葉中的黃酮類化合物就已基本溶出。因此，選定提取次數為1 次。

圖5 優化前后0.3 mg/mL 漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物光溶血試驗Fig.5 The RBC hemolysis with 0.3 mg/mL of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160d)

綜上所述，并考慮提取效率、控制成本和節約能源等因素，得到漢麻(160 d)葉95%的乙醇提取物的最佳工藝條件為:料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時間2 h，提取1 次。

優化前后乙醇提取物光溶血試驗結果見圖5，在光溶血試驗體系中添加0.3 mg/mL 優化后的漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物后，發現紅細胞溶血率比優化前的提取物有明顯降低，說明其抗紫外輻射能力有所增強，優化成功。

2.3 漢麻提取物的化學成分分析

最佳提取物的總糖含量、蛋白含量、總黃酮含量結果見表4。雖然漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的主要成分為黃酮(0.571 g/g)，但漢麻提取物中的抗紫外關鍵功效成分及其作用機理，仍需進一步深入研究。

表4 漢麻(160 d)葉95%乙醇粗提物主成分含量Table 4 Components of 95% ethanol extract of China-hemp leaves (160 d)

2.4 漢麻提取物的安全及穩定性檢測

紅細胞溶血實驗結果見圖6，從圖中看出，將漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物配成0.5%和1%的溶液，其溶血率分別為3.2%和7.88%，均低于上限(20%)，表明該提取物未使紅細胞發生明顯的受損和溶血現象，因而無明顯刺激性。

圖6 0.5%及1%漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物溶血率Fig.6 The hemolytic rates of 0.5% and 1% China-hemp extracts

在雞胚絨毛尿囊膜試驗中(見表5)，0.5%優化漢麻葉提取物(1～3 號)的IS 平均值為0.647，而1%優化漢麻葉提取物(4～6 號)的IS 平均值為0.925。可見雖然提取物的IS 值也隨著濃度而升高，但其IS 值均小于1，所以該漢麻葉提取物無明顯刺激性。

在穩定性實驗中，漢麻(160 d)葉95%乙醇提取物的溶液pH 穩定性良好，在冷熱交替穩定性測試中，其pH 指標始終保持在5.80±0.2，未出現沉淀。在耐寒(4 ℃)熱(40 ℃)及光穩定性測試中，提取物僅在最后一周出現少許沉淀及顏色變化，穩定性總體較好。

表5 雞胚絨毛尿囊膜試驗IS 值的測定結果Table 5 IS values of China-hemp extracts determined in CAM test

注1:IS 的計算公式為:

3 結論

通過紫外光譜掃描、清除自由基實驗、光溶血實驗對不同時期、不同部位的漢麻提取物進行了抗紫外功效評價和優選。其中，漢麻(160 d)葉95%的乙醇提取物在UV-B 區、UV-A 區的平均紫外線吸收率為61.23%、70.84%，抗紫外作用優于其它提取物。該提取物還有較強的DPPH·自由基清除能力(IC50值2583.7 μg/mL)，并能有效地能夠阻止紫外線照射對紅細胞造成的損傷(添加0.3 mg/mL 提取物后，紅細胞光溶血率下降63.2%)。對漢麻(160 d)葉進一步優化提取工藝，確定最佳工藝參數為:料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時間2 h，提取1次;并對優化后漢麻葉提取物進行了初步的化學成分分析(主要成分為黃酮)和安全性及穩定性評價，認為該提取物穩定安全，已初步具有了作為防曬化妝品功效原料的開發價值［18］。但若要將漢麻成熟葉95%乙醇提取物作為一種功效添加劑研制出高效的防曬化妝品，則還需重點解決天然防曬劑的復配問題，即對化妝品基質中油相原料、乳化劑和成膜劑等成分的選擇進行優化研究［19］。

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