葛內生真菌抑菌活性菌株的篩選及鑒定

萬陜寧，麻玉萍，王家穩，魏希穎

陜西師范大學生命科學學院教育部藥用植物資源與天然藥物化學重點實驗室，西安 710119

研究報道，植物內生菌具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化等多種生物活性，對于植物內生真菌抗菌活性的研究是內生真菌研究的主要內容［1，2］，也是人們目前尋找新型藥物的重要來源［3］。

葛(Pueraria lobata)，是我國衛生部首批批準的藥食兩用植物，其根、莖、葉、花均可入藥，臨床上常用單味藥或復方制劑治療冠心病、心肌梗塞和高血壓病，現已廣泛用于食品、藥品、化妝品等領域［4］。本研究在實驗室前期研究的基礎上，對分離自葛的112 株內生真菌的抗菌作用進行研究，以期為抗菌藥物的獲得找到新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

內生真菌:陜西師范大學應用微生物實驗室保存的112 株葛內生真菌。

供試指示細菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26003)、大腸桿菌(Escherichia coli A70)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereuss A18)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium A20)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans A89)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis A99)、白色葡萄球菌(Staphylococcus white A113)、藤黃八疊球菌(Sarcinaluteu A119)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidernidis 2429)、肺炎鏈球菌(streptococcus pnuemoniae 1692)。

指示植物病原真菌:番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、蘋果樹腐爛病菌(Valsa mali Var)、葡萄炭疽病菌(Colletortrichum)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、玉米大斑病菌(Helminthosporiummaydis)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、小麥根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)。供試菌株均由陜西省微生物研究所提供，陜西師范大學應用微生物實驗室保存。

1.1.2 試劑

青霉素鈉(哈藥集團制藥廠生產，批號:A061115207);鏈霉素(Amresco，批號:LOTZO10/07);氟康唑(山東康寧藥業有限公司，批號;H44023370);兩性霉素(AmB)(武漢遠成共創制藥有限公司，批號:H20070816);Taq 聚合酶、擴增緩沖液、DNA Marker DL2000，購自上海生工生物公司。

1.1.3 培養基［5］

細菌培養基:牛肉膏蛋白胨培養基;真菌培養基:PDA 培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

細菌的活化:將指示菌接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，37 ℃恒溫培養18～24 h，備用。

真菌的活化:將指示真菌接種到PDA 斜面培養基上，28 ℃的恒溫培養48～72 h，備用。

1.2.2 葛內生真菌抗細菌活性觀察［6］

吸取200 μL 指示菌菌懸液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養基表面，制成含菌平板，其上放置3 個無菌牛津杯，用移液槍加入200 μL 葛內生真菌的發酵液，等量的青霉素鈉(80 IU/mL)和鏈霉素(50 mg/mL)作為陽性對照，無菌水做陰性對照，以上均在37 ℃培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，抑菌圈的邊緣以肉眼見不到菌明顯生長為限。選取抑菌作用較好的菌株繼續進行下一步研究。

1.2.3 葛內生真菌抗植物病原真菌活性的觀察

將抗細菌效果較好的內生真菌，運用皿內對峙法［7］進行抗真菌活性觀察，即將內生真菌和指示真菌分別用5 mm 的打孔器制成菌餅，內生真菌菌餅放在固體培養基的中央，在其周圍等徑放置4 個指示菌的菌餅，28 ℃恒溫培養72 h，用PDA 培養基上正常培養的植物病原菌作為對照，選出有抑菌帶的菌株。

將上述實驗中具有明顯抑菌帶的菌株，參照郭建新報道的紙片擴散法［8］進行復篩，方法如下:將植物病原菌菌懸液稀釋至濃度為108CPU/mL，吸取200 μL 涂布到PDA 平板上，制成含菌板。將直徑為5 mm 的無菌濾紙片放在含菌板上，其上加20 μL真菌發酵液，做3 個重復，28 ℃恒溫培養72 h，記錄菌株發酵液抑菌圈的直徑，結果取平均值。兩性霉素AmB(1 mg/mL)和氟康唑(1 mg/mL)作為陽性對照，無菌水作為陰性對照，挑選出抑菌圈直徑最大的菌株。

1.2.4 廣譜抗菌菌株的形態學鑒定

采用真菌插片培養方法對高抗菌活性內生真菌的菌落、菌絲和孢子等特征進行顯微鏡觀察，參照《真菌鑒定手冊》［9］和《現代醫學真菌鑒定手冊》［10］進行鑒定。

1.2.5 廣譜抗菌菌株分子生物學鑒定:

用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')經PCR 從真菌基因組DNA 中擴增出rRNA基因的內部轉錄間隔區(ITSs)。反應條件:95 ℃5 min;95 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環;72 ℃10 min。PCR 產物的純化:PCR 產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA 凝膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠中的PCR 產物。純化后的PCR產物由上海生工生物技術服務有限公司進行測序。

2 結果與討論

2.1 葛內生真菌抗細菌活性測試結果

葛內生真菌抗細菌活性測試結果如表1 及表2所示。從表1 中可以看出，在所有內生真菌中，抗菌活性菌株有74 株，占分離到內生真菌的66%。其中根中得到22 株，莖中有47 株，葉中有5 株。其中高活性菌株(抑菌圈Φ≥15 mm)有39 株，占抗菌活性菌株的42%。

從表2 中可看出，在39 株高活性菌株中，J1-3、J5-2、J24-1、J25-2、J31-3、J100-2、GG9 這7 株菌對8種以上指示菌均有抑制作用，且抑菌效果較好。

表1 葛內生真菌的次生代謝產物的抑菌活性及其分布Table 1 The antimicrobial activities and distribution of endophytic fungi metabolites in Pueraria lobata

注:低活性:抑菌圈Φ＜10 mm，中等活性:抑菌圈10 mm≤Φ＜15 mm，高活性:抑菌圈Φ≥15 mm Note:Low activity:Φ＜10 mm;Middle activity:10 mm≤Φ＜15 mm;High activity:Φ≥15 mm.

表2 39 株高活性葛內生真菌代謝產物抑細菌實驗結果Table 2 Antimicrobial experiment of high active 39 strains

注:①G 表示根部;J 表示莖部;Y 表示葉部。②-:Φ＜10 mm;+:10 mm＜Φ＜15 mm;++:15 mm＜Φ＜20 mm;+++:Φ＞25 mm。③DS:陰性對照無菌水;DL:陽性對照鏈毒素(50 mg/L);DQ:對照青霉素(80 IU/mL)。Note:①G—Root，J—Stem，Y—Leaf.②-:Φ＜10 mm;+:10 mm＜Φ＜15 mm;++:15 mm＜Φ＜25 mm;+++:Φ＞25 mm.③DS:sterile water (negative control);DL:streptomycin (50 mg/L)(positive control);DQ:penicillin(80 IU/mL)(positive control).

2.2 葛植物內生真菌抗植物病原菌活性測試結果

對7 株具有較好抗細菌活性的菌株，進行抗植物病原菌活性測試，結果見表3。從表3 中可發現，J5-2、J31-3、J100-2 對幾種不同的病原真菌有較廣泛的抑制作用。其中J100-2 對5 株病原真菌(蘋果樹腐爛病菌、番茄灰霉菌、油菜菌核病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌)均有抑制作用，是一株廣譜的抗菌活菌性菌株。

表3 葛內生真菌代謝產物抗真菌實驗Table 3 Antimicrobial experiment of Pueraria lobata

2.3 廣譜抗菌菌株J100-2 的形態學鑒定

經培養觀察發現J100-2 菌株在PDA 培養基上培養3 天后，菌落呈直徑為3～4 cm 的圓形，表面干燥，中央凸起呈褐黑色，四周較松散成黑色厚絨狀，邊緣為白色，菌絲呈放射狀向四周生長，菌落背面為黃色。經顯微觀察發現其菌絲較細，有隔，分生孢子囊呈球形。結果見圖1 和2。根據菌株J100-2 的菌落形態和顯微特征，初步將其鑒定為莖點霉屬真菌Phoma macrostoma.

圖1 J100-2 的菌落形態特征Fig.1 colonial characteristics of J100-2

圖2 J100-2 的菌絲體和孢子(10 ×40)Fig.2 Spore and hgphae morphlology of J100-2 (10 ×40)

2.4 廣譜抗菌菌株J100-2 的ITS 序列分析

利用ITS 通用引物ITS1 和ITS4 經PCR 從內生真菌J100-2 基因組DNA 中擴增出長約700bp 的單一DNA 條帶，對純化的PCR 產物進行DNA 測序分析。結果表明，J100-2 的ITS 序列長750bp，將其序列與GenBank 數據庫進行BLAST 比對分析，對菌株的18SrRNA 序列采用Clustalx 軟件進行序列比對，然后利用MEGA 4.0 軟件的最大可能性法(Maximum Likelihood methods)，構建了分離得到的產活性菌株及同源性較高的系統發育樹。并且繪制出18SrRNA 序列系統發育樹(圖3)。

結果表明:該序列與莖點霉屬的真菌Phoma macrostoma.的ITS 序列(序列號為HM755951.1)同源性為99%，由圖3 看出菌株J100-2 與HM755951.1 處于一個最小的分枝內，進化上距離最近。結合前面進行的形態學特征的鑒定，從而進一步驗證菌株J100-2 與Phoma macrostoma.是同一個種，根據最新版的《真菌詞典》將其無性階段歸于巨腔莖點霉。其分類地位如下:半知菌(Deuteromycotia)腔胞綱(Coelomycetes)球殼孢目(Sphaeropsidales)莖點霉屬(phoma)巨腔莖點霉(P.macrostoma)

圖3 J100-2 內生真菌系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of endophytic fungus J100-2

2.5 討論

植物內生菌作為抗生素來源的一個新的研究領域，發展潛力巨大。其產生的抗菌物質往往是新穎的，研究顯示，51%的從植物內生真菌分離的生物活性物質是以前沒有發現的化合物［11］;且大多數對動、植物細胞無毒;內生真菌的次級代謝產物:生物堿、環肽類、萜類、甾體類、醌類化合物、脂類、酚類及有機酸等都具有一定抗菌活性［12］，它們的天然產物都可以殺滅或抑制很多病原微生物。

本實驗對葛的不同組織分離到的內生真菌進行抗菌活性菌株的大規模的篩選，得到39 株活性較高的菌株，說明葛內生真菌中抑菌活性菌株的普遍性;有7 株菌對細菌具有良好的抑制作用，其中5 株菌對植物病原菌具有不同程度的抑制作用，尤其是J100-2 對多種病原菌具有抑制作用，結果表明葛內生真菌在果樹病害防治領域具有進一步開發的價值，以后可開展活性代謝產物的提取及抑菌活性物質成分分析的進一步研究。

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